劉小云 吳小延 邵瓊 龍亞康 王海云 鄧玲

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡人數(shù)較高的惡性腫瘤。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，其中，NSCLC占85%以上。早期的NSCLC治療主要選擇手術(shù)，但多數(shù)NSCLC患者初診時(shí)已是中晚期，不適于手術(shù)，只能選擇以藥物治療為主［1］。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，靶向治療使NSCLC的治療朝著更加精準(zhǔn)的方向發(fā)展［2-4］。近年來，多項(xiàng)研究致力于評(píng)估液體活檢應(yīng)用的可能性［5-6］。液體活檢分析的腫瘤生物標(biāo)志物包括血漿游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、外泌體等。

cfDNA和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）都是血液生物標(biāo)志物，cfDNA是癌細(xì)胞和正常細(xì)胞凋亡后釋放入外周血的DNA片段，ctDNA是腫瘤細(xì)胞破裂后釋放入外周血的DNA片段。血漿cfDNA基因檢測(cè)可用于識(shí)別靶向藥物靶點(diǎn)、評(píng)估治療反應(yīng)、監(jiān)測(cè)耐藥性、檢測(cè)腫瘤殘留病灶等［7-8］。目前，NSCLC常見的驅(qū)動(dòng)基因包括 EGFR、ALK、ROS1、KRAS、ERBB2、RET、PIK3CA、BRAF 等［9］。對(duì)于攜帶相應(yīng)基因敏感突變的NSCLC患者，采用靶向藥物治療可以顯著延長(zhǎng)患者的生存期，改善患者的生存質(zhì)量。因此，對(duì)于初診患者可以檢測(cè)基因突變情況，確定精準(zhǔn)的治療方案。對(duì)于已采用靶向治療患者，需要監(jiān)測(cè)患者耐藥突變情況，以及時(shí)改進(jìn)治療方案。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)血漿ctDNA標(biāo)本采用基于分子標(biāo)簽的高通量二代測(cè)序技術(shù)，分析NSCLC患者的相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因突變情況，評(píng)估血漿ctDNA二代測(cè)序技術(shù)用于指導(dǎo)靶向用藥及進(jìn)展后耐藥監(jiān)測(cè)的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究經(jīng)中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。共納入163例2017年7月至2019年7月期間在中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的NSCLC患者的血液標(biāo)本，其中男性97例（59.5%），女性66例（40.5%）?；颊吣挲g28～88歲，其中60歲以上90例（55.2%），60歲以下73例（44.8%）。無吸煙史57例（35.0%），有吸煙史42例（25.8%），情況不明64例（39.2%）。肺腺癌130例（79.8%），肺鱗癌 8例（5.0%），分型不明 25例（15.2%）。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的33例（20.2%），Ⅲ～Ⅳ期的101例（62.0%），分期不明的29例（17.8%）。

1.2 血漿游離腫瘤DNA提取及石蠟包埋組織DNA提取

采集10 mL外周血樣品至EDTA抗凝管。為避免血漿cfDNA被血細(xì)胞溶解釋放的基因組DNA污染，抽取的外周血樣品需在4℃下保存并于2 h內(nèi)進(jìn)行血漿分離。采用2次離心法分離血漿。先將10 mL血液樣品在4℃，1 600 g條件下離心15 min。吸取上清，將上清置4℃，16 000 g條件下離心15 min。吸取上清至新的1.5 mL離心管中。利用血漿用比色卡進(jìn)行比色，評(píng)估血液的溶血程度。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid extract kit（Qiagen）提取樣品中的cfDNA。石蠟包埋組織DNA 使用 QIAamp DNA FFPE Tissue Kits（Qiagen公司）進(jìn)行提取。提取后的ctDNA及腫瘤組織DNA樣本均使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行定量分析。

1.3 組織樣本ARMS-PCR檢測(cè)

利用組織樣本ARMS-PCR檢測(cè)試劑盒（人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，金菩嘉）對(duì)組織樣本的EGFR突變情況進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明進(jìn)行操作。該試劑盒可對(duì)突變體DNA含量＞1%的樣本品實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定檢測(cè)。檢測(cè)覆蓋EGFR基因18、19、21號(hào)外顯子36個(gè)EGFR-TKI敏感突變位點(diǎn)，20號(hào)外顯子包括T790M、S768I、插入突變等9個(gè)耐藥突變位點(diǎn)。

1.4 高通量捕獲測(cè)序

利用血清/血漿游離DNA高通量測(cè)序試劑盒（思路迪）對(duì)cfDNA樣品進(jìn)行二代測(cè)序文庫構(gòu)建、捕獲，包括建庫和目標(biāo)區(qū)域捕獲。ctDNA的投入量為60 ng，最低不低于30 ng。目標(biāo)區(qū)域捕獲采用150基因panel進(jìn)行捕獲。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒（血清/血漿游離DNA高通量測(cè)序試劑盒，思路迪）說明進(jìn)行操作。將捕獲的DNA片段于Illumina NextSeq500測(cè)序儀（Illumina）上測(cè)序，選用雙端75 bp測(cè)序模式。血漿ctDNA測(cè)序深度要求為平均測(cè)序深度大于10 000X，有效測(cè)序深度大于2 000X。

1.5 血漿ctDNA二代測(cè)序數(shù)據(jù)分析

Illumina NextSeq500測(cè)序儀（Illumina）產(chǎn)生的下機(jī)數(shù)據(jù)為bcl格式文件，使用bcl2fastq Conversion Software（Illumina）將 bcl格式文件轉(zhuǎn)換為fastq格式的文件。獲取拆分的原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，首先利用BWA MEM［10］將測(cè)序序列比對(duì)到參考人類基因組上（hg19），比對(duì)軟件參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)。比對(duì)結(jié)果處理步驟包括利用fgbio軟件，根據(jù)基因組比對(duì)信息和分子標(biāo)簽信息，將來源于同一條DNA片段的序列（reads）分類為一組，生成一致性序列（consensus reads）。利用BWA MEM將生成的consensus reads比對(duì)到參考人類基因組上?；诒葘?duì)后的測(cè)序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本原始下機(jī)數(shù)據(jù)量、捕獲區(qū)域原始測(cè)序深度、捕獲區(qū)域有效測(cè)序深度、捕獲上靶率、reads比對(duì)成功率、捕獲區(qū)域95%位點(diǎn)達(dá)標(biāo)有效深度等質(zhì)控信息?；谌ブ睾蟮谋葘?duì)結(jié)果，完成單堿基替換類型位點(diǎn)和短片段插入/缺失的查找。進(jìn)一步基于背景測(cè)序錯(cuò)誤率估計(jì)、正常人cfDNA背景模型、變異的正負(fù)鏈平衡、變異位點(diǎn)在被檢測(cè)序列中出現(xiàn)的位置以及變異位點(diǎn)是否由平臺(tái)系統(tǒng)錯(cuò)誤造成等條件完成過濾，保留高可信度的體細(xì)胞變異。完成所有高可信度變異的注釋，并過濾去除所有良性變異位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 初診初治NSCLC ctDNA驅(qū)動(dòng)基因突變譜

共納入98例初診初治的NSCLC患者，其中肺腺癌73例，肺鱗癌8例，其他17例分型不明。98例初診初治的NSCLC患者中11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的詳細(xì)突變信息見圖2，包括單堿基突變、小片段插入缺失、融合突變、拷貝數(shù)擴(kuò)增4種突變類型。圖中每列代表一例患者中11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的突變情況，每行代表一個(gè)基因在98例患者中的突變情況，圖中也展示了98例患者的性別、年齡、腫瘤分型、臨床分期、吸煙史情況，上方條形圖統(tǒng)計(jì)了每例樣本中11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的突變個(gè)數(shù)，右方條形圖統(tǒng)計(jì)了每個(gè)基因在98例患者中的突變頻數(shù)。其中，37例（37.8%）患者未檢出肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變。其余患者中 TP53、EGFR、ERBB2、RET、KRAS、ALK、PIK3CA、BRAF、MET、ROS1、NRAS的突變頻率分別為33%、24%、10%、8%、7%、6%、4%、3%、3%、3%和1%（見圖2）。TP53基因突變是NSCLC患者中檢出率最高的，其突變?cè)诟鞴δ苡虻姆植迹妶D1。23例（24%）EGFR突變患者中，最為常見的為L(zhǎng)858R突變（34.8%，8例）和19號(hào)外顯子缺失突變（26.1%，6例），2例（8.7%）檢出20號(hào)外顯子插入突變，1例（4.3%）檢出EGFR拷貝數(shù)擴(kuò)增，1例（4.3%）檢出EGFR A864V、E746_A750del和EGFR拷貝數(shù)擴(kuò)增3種突變，其他突變包括 K757R、A613T、A647T、T678M、L833V+H835L（21.7%，5例），EGFR詳細(xì)突變信息見圖1（不包括EGFR拷貝數(shù)擴(kuò)增）。7例患者（7.0%）檢出KRAS突變，1例為KRAS拷貝數(shù)擴(kuò)增，其他6例檢出2號(hào)外顯子突變（5例G12V/C/R突變，1例G13D突變）。ALK融合在3例患者中被檢測(cè)，均為ALK-EML4融合。3例患者檢出ERBB2 Y772_A775dup突變。在1例患者中檢出NRAS G12D突變。

2.2 EGFR-TKI靶向治療進(jìn)展后耐藥突變

圖1 TP53基因和EGFR基因突變功能域分布Figure 1 Mutation distribution in the functional domains of TP53 and EGFR

圖2 98例初診初治NSCLC患者突變譜分布熱圖Figure 2 The mutation spectrum of 98 patients with tyrosine kinase inhibitor（TKI）-na?ve non-small cell lung cancers

共有65例接受一代、二代或三代EGFR-TKI靶向治療的NSCLC患者，其中57例患者接受EGFR-TKI治療后進(jìn)展，8例未出現(xiàn)進(jìn)展，未納入進(jìn)展后耐藥突變分析。57例治療后進(jìn)展的患者中，42例接受一代TKI治療，1例接受二代TKI治療，1例接受三代TKI治療，3例接受一代TKI治療后改用二代TKI治療，10例接受一代TKI治療后改用三代TKI治療。21例（36.8%）接受EGFR-TKI治療后進(jìn)展的患者檢出T790M耐藥突變。共11例患者接受三代TKI靶向藥治療，其中3例（27.3%）進(jìn)展患者出現(xiàn)T790M與T797S順式耐藥突變。其他耐藥突變包括KRAS基因突變（2例）、MET基因擴(kuò)增（1例）以及PIK3CA基因突變（8例）。11個(gè)NSCLC驅(qū)動(dòng)基因在各EGFRTKI靶向治療后進(jìn)展患者中的突變分布情況，見圖3。

圖3 一代、二代、三代EGFR-TKI靶向治療進(jìn)展后耐藥突變分布Figure 3 Resistance mutation distribution in 57 EGFR-TKI relapsed patients

2.3 ARMS-PCR組織EGFR突變檢測(cè)與NGS ctDNA EGFR突變檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

在納入的163例NSCLC患者中，29例患者存在配對(duì)的組織樣本ARMS-PCR檢測(cè)結(jié)果。29例患者均為組織樣本檢測(cè)結(jié)果為EGFR突變陽性，包括13例檢出EGFR基因19號(hào)外顯子缺失突變，15例檢出EGFR基因L858R突變，1例檢出EGFR基因20號(hào)外顯子錯(cuò)義突變。29例NSCLC患者中，18例患者的臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期患者為4例，7例患者的臨床分期為不詳。29例患者的病理分型均為肺腺癌，3例患者腫瘤直徑＞5 cm，其余患者腫瘤大小均不超過3 cm。4例患者ctDNA二代測(cè)序方法檢出EGFR突變（1例K757R、1例L858R、1例E746_A750del、1例L858R合并V834L突變）（見圖4）。采用ctDNA二代測(cè)序方法檢出EGFR突變的4例患者中，3例腫瘤大?。? cm，3例臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期，1例分期為Ⅰ期。

3 討論

圖4ARMS-PCR組織EGFR突變與NGS ctDNA EGFR突變檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Figure 4 The comparison between EGFR mutations in tissues by ARMS-PCR and in plasma by NGS

近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療成為關(guān)注的熱點(diǎn)，NSCLC驅(qū)動(dòng)基因相關(guān)研究也取得了巨大進(jìn)展。特別是二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得NSCLC治療由標(biāo)準(zhǔn)化的治療方法向基于基因突變的靶向治療方法轉(zhuǎn)變。EGFR基因突變是NSCLC患者最常見的突變之一，目前常用的EGFR靶向治療藥物包括一代/二代/三代TKI。同時(shí)，一代/二代EGFR-TKI靶向用藥的最常見耐藥機(jī)制為EGFR T790M突變。目前，臨床上基因突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是腫瘤組織檢測(cè)，但由于腫瘤組織取材限制、腫瘤的異質(zhì)性、難于采用腫瘤組織動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)靶向用藥后基因變異狀況等［11-12］，液體活檢作為一種無創(chuàng)、易取樣、利于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)方法，對(duì)于指導(dǎo)靶向治療具有極大應(yīng)用前景。納入163例NSCLC患者，分析了NSCLC相關(guān)的11個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的突變情況。根據(jù)結(jié)果分析，ctDNA用于初診初治NSCLC驅(qū)動(dòng)基因突變檢測(cè)和NSCLC靶向治療耐藥突變情況檢測(cè)可能存在以下問題。

首先，采用ctDNA二代測(cè)序方法檢測(cè)NSCLC EGFR突變的檢出率為24%，低于文獻(xiàn)報(bào)道的亞洲人群中EGFR突變率［13］。由于納入的初診初治NSCLC患者中，早期肺癌患者有33例，臨床分期不詳患者17例，而血液中ctDNA含量與腫瘤分期或腫瘤負(fù)荷有關(guān)，導(dǎo)致突變的檢出率低于文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率。其次，早期腫瘤患者cfDNA中ctDNA含量可能低于1%［14］，正常組織釋放的cfDNA對(duì)腫瘤細(xì)胞釋放的ctDNA具有稀釋作用，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不可避免的出現(xiàn)假陰性的情況。因此，對(duì)于初診初治患者，需要根據(jù)患者的腫瘤分期或腫瘤負(fù)荷情況來確定是否選擇ctDNA檢測(cè)。在ctDNA檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，需要考慮假陰性的情況，仍需建議患者以腫瘤組織檢測(cè)作為治療依據(jù)。

EGFR T790M突變是一代/二代EGFR-TKI靶向治療進(jìn)展耐藥的最常見機(jī)制，可在50%以上的耐藥患者中檢出此突變［15-16］。靶向治療后耐藥進(jìn)展的患者中，T790M突變的檢出率為36.8%，低于文獻(xiàn)中報(bào)道的突變率。由于部分耐藥進(jìn)展患者在ctDNA基因檢測(cè)前接受過化療，導(dǎo)致本次ctDNA突變檢測(cè)結(jié)果可能并不能夠代表患者真實(shí)的耐藥分子機(jī)制。進(jìn)而導(dǎo)致T790M的檢出率低于文獻(xiàn)中報(bào)告的檢出率。因此，采用ctDNA二代測(cè)序方法監(jiān)測(cè)患者耐藥情況時(shí)，需要對(duì)患者采血時(shí)間精準(zhǔn)把控。采用ctDNA二代測(cè)序方法監(jiān)測(cè)耐藥情況的優(yōu)勢(shì)在于，相比于腫瘤組織，血漿cfDNA基因檢測(cè)可以及時(shí)有效的監(jiān)測(cè)治療過程中耐藥突變情況，且抽血過程相對(duì)無創(chuàng)，患者能夠接受多次采樣，容易實(shí)現(xiàn)對(duì)治療反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。目前，多項(xiàng)研究開發(fā)了針對(duì)低豐度變異的二代測(cè)序檢測(cè)技術(shù)［17-20］，以在體內(nèi)正常cfDNA的背景噪音中檢測(cè)這些罕見的ctDNA變異。

組織EGFR突變陽性患者與ctDNA檢測(cè)EGFR陽性患者之間的一致性僅為13.8%。對(duì)29例患者的臨床分期及腫瘤大小分析發(fā)現(xiàn)，僅4例為Ⅲ～Ⅳ期，7例患者的臨床分期為不詳，僅3例患者腫瘤直徑＞3 cm，其余患者腫瘤直徑均不超過3 cm。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，早期腫瘤患者和腫瘤直徑小于3 cm的腫瘤患者中基因突變的檢出率相對(duì)較低［21-22］?；谝恢滦越Y(jié)果，對(duì)于早期腫瘤患者需要進(jìn)行基因檢測(cè)指導(dǎo)靶向治療時(shí)，選擇樣本類型時(shí)需謹(jǐn)慎，仍需選擇腫瘤組織作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，避免采用血漿ctDNA檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的情況，耽誤患者治療。

綜上所述，雖然對(duì)于早期NSCLC患者或者腫瘤負(fù)荷較低的患者，二代測(cè)序檢測(cè)血漿ctDNA存在假陰性的可能，但此方法不僅能夠檢出初診初治NSCLC患者中靶向治療的敏感突變，還可以對(duì)靶向治療進(jìn)展后的耐藥突變情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。采用的基于分子標(biāo)簽的二代測(cè)序方法，能夠減少建庫操作和測(cè)序過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，用于血漿ctDNA基因突變檢測(cè)時(shí)可提高真實(shí)突變的檢出。因此，在對(duì)抽血對(duì)象的腫瘤分期和腫瘤負(fù)荷、患者治療情況以及抽血時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格把控的條件下，可選擇基于分子標(biāo)簽的二代測(cè)序檢測(cè)技術(shù)來指導(dǎo)NSCLC患者的個(gè)性化用藥。