杜彥丹 牛藝卿 鄭海軍 王曉艷 姜玉海 陳海秋 李寅雁 孫剛李春雨 陸德生 孫輝★

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是中老年男性常見的一種惡性腫瘤，中國PCa發(fā)病率明顯低于歐洲國家，隨著人口老齡化及生活水平的提高，正呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。PCa中腺泡腺癌占95%以上，通稱為PCa［1］，其不是一種獨立疾病，能夠侵襲轉(zhuǎn)移至膀胱、血管神經(jīng)束、精囊，從而引起全身系統(tǒng)的病理生理改變。大量研究顯示，前列腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal-transition，EMT）密不可分［2-3］，它與表觀遺傳修飾在腫瘤侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程中發(fā)揮著重要作用。微環(huán)境中的轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth foctor β1，TGFβ1）由基質(zhì)細胞分泌，其信號通路下游SMAD磷酸化，可進一步激活轉(zhuǎn)錄因子啟動EMT過程［4］。有研究表明具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子Snail1參與EMT的發(fā)生，多種轉(zhuǎn)移及復發(fā)的上皮細胞腫瘤中均有Snail1的高表達［5-6］，這可能與Snail1轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾有關(guān)。賴氨酸及精氨酸甲基化多發(fā)生在組蛋白H3各位點［7］，其中H3K9甲基化是特殊染色質(zhì)形成和基因轉(zhuǎn)錄沉默的表觀遺傳標志，可以抑制基因轉(zhuǎn)錄，其去甲基化酶KDM4A參與催化去除H3K9甲基化過程。本課題旨在通過沉默KDM4A表達，改變Snail1甲基化富集程度，觀察PC3細胞形態(tài)學變化及Snail1的表達變化，闡明前列腺癌發(fā)生EMT的重要機理。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

人前列腺癌PC3、DU145細胞株購自ATCC公司。胎牛血清、1640培養(yǎng)液、胰酶購自Gibco公司；DMSO購自美國Sigma公司；Trizol為荷蘭Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker為TakaRa公司產(chǎn)品；所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；BCA蛋白定量試劑購自美國Thermo公司，所有抗體均為美國Cell Signaling公司生產(chǎn)；免疫組化試劑來源于上海McLean公司。

1.2 細胞實驗

1.2.1 形態(tài)學觀察

當細胞生長至90%匯合時，無血清饑餓細胞24 h，0.5%FBS的1640培養(yǎng)基中添加10和20 ng/mL TGFβ1處理細胞 24、48 h，使用熒光顯微鏡對細胞形態(tài)的改變進行觀察和記錄。

1.2.2 細胞劃痕（遷移）實驗

培養(yǎng)皿下畫線、鋪板并培養(yǎng)細胞至貼壁。給藥后，無血清饑餓培養(yǎng)。待細胞生長至80%，垂直于六孔板的底部直線劃線，按照不同時間段及給藥濃度留取圖片并分析結(jié)果。

1.2.3 細胞侵襲（Transwell）實驗

Transwell小室內(nèi)平鋪100 μL基質(zhì)膠，小室下加入500 μL 1640培養(yǎng)基，放入小室時避免產(chǎn)生氣泡。小室內(nèi)吸入100 μL無血清細胞懸液，孵育24、48 h，固定、結(jié)晶紫染色后分析結(jié)果。

1.3 RT-PCR檢測人前列腺癌細胞株中EMT相關(guān)maker的變化

處理方法如1.2.1，Trizol法提取細胞總RNA，取 A260/A280比值落于 1.8～2.0之間的RNA進行實驗，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA序列為模板，選用的內(nèi)參基因為GAPDH，擴增后按以下計算方法分析數(shù)據(jù)：2-△△Ct=2［（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）待測樣本-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照樣本］。

1.4 Western Blot檢測人前列腺癌細胞株中EMT相關(guān)maker的變化

取對數(shù)生長期的前列腺癌細胞，PBS洗滌后加入細胞變性裂解液，煮沸、離心、取上清液，加入蛋白loading buffer，檢測蛋白濃度。取上樣量40 g的蛋白，以β-actin作為參照，進行12%SDS-PAGE電泳，隨后進行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應及發(fā)光顯影，使用與β-actin的比值表示各組蛋白表達水平。

1.5 免疫組化實驗

收集內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科前列腺良性增生組織（對照組）及Gleason分級4級以上的前列腺癌組織（實驗組）各60例。將標本依次進行固定、包埋及切片；置于新鮮二甲苯中浸泡，瀝干后按順序放入無水乙醇、90%乙醇及75%乙醇中；蒸餾水沖洗1 min，放入PBS緩沖液中；組化染色后觀察組織片，分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學分析

以上實驗均有效重復三次以上，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，使用SPSS 22.0軟件中方差分析來處理實驗結(jié)果。P＜0.05或P＜0.01差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 TGFβ1誘導后前列腺癌細胞系形態(tài)學及EMT相關(guān)Marker變化

培養(yǎng)人前列腺癌PC3和DU145細胞，觀察TGFβ1誘導后細胞形態(tài)變化、細胞遷移和侵襲試驗結(jié)果。利用Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測細胞發(fā)生EMT時相關(guān)Marker的表達變化。

2.1.1 前列腺癌PC3細胞形態(tài)學變化

按照1.2.1處理細胞后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變，結(jié)果顯示：PC3和DU145細胞均由橢圓形變?yōu)殚L梭型（圖1 A、B），其中PC3細胞形態(tài)變化較明顯，課題組篩選出PC3細胞進行后續(xù)實驗（圖2A、B）。劃痕和Transwell侵襲實驗結(jié)果表明：TGFβ1誘導PC3細胞后，細胞的遷移和侵襲能力增強（圖3、4）。

2.1.2 RT-PCR和Western blot檢測PC3細胞EMT相關(guān)Marker表達的變化

TGFβ1誘導PC3細胞，EMT相關(guān)Marker表達發(fā)生改變，E-cadherin表達下調(diào)，Snail1和Vimentin表達上調(diào)，其中Snail1表達變化最顯著（圖5）；Western blot結(jié)果也顯示Snail1的表達量顯著增高。（圖6、7）。

圖1 DU145細胞經(jīng)TGFβ1誘導24、48 h后光學顯微鏡下形態(tài)學的變化Figure 1 Morphological changes of DU145 cells induced by TGFβ1 for 24 and 48 hours under optical microscope

圖2 PC3細胞經(jīng)TGFβ1誘導24、48 h后光學顯微鏡下形態(tài)學的變化Figure 2 Morphological changes of PC3 cells induced by TGFβ1 for 24 and 48 hours under optical microscope

圖3 PC3細胞經(jīng)20 ng/mLTGFβ1處理24、48 h后，細胞劃痕實驗結(jié)果Figure 3 Scratch test results of PC3 cells treated with 20 ng/mL TGFβ1 for 24 and 48 hours

圖4 PC3細胞Transwell實驗結(jié)果Figure 4 Transwell experiment results of PC3 cells

圖5 TGFβ1誘導PC3細胞，EMT相關(guān)Marker mRNA水平的變化Figure 5 mRNA changes of EMT-related Marker in PC3 cells induced by TGFβ1

圖6 TGFβ1誘導PC3細胞24 h后相關(guān)蛋白的表達Figure 6 Expression of related proteins in PC3 cells induced by TGFβ1 for 24 hours

圖7 TGFβ1誘導PC3細胞48 h后相關(guān)蛋白的表達Figure 7 Expression of related proteins in PC3 cells induced by TGFβ1 for 48 hours

2.2 前列腺良性增生組織及前列腺癌組織中EMT相關(guān)Marker的表達結(jié)果

對照組及實驗組組織標本免疫組化結(jié)果顯示：對照組中E-cadherin細胞膜表達呈強陽性，Vimentin、Snail細胞質(zhì)表達呈弱陽性，見圖8A；實驗組中E-cadherin細胞膜表達弱陽性，Vimentin、Snail細胞質(zhì)表達強陽性，見圖8B。可見組織病理學層面Snail在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中也起了決定性作用。

2.3 沉默KDM4A，PC3細胞形態(tài)學及轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達的變化

培養(yǎng)前列腺癌PC3細胞，進行TGFβ1及TGFβ1+siKDM4A處理。20 ng/mL TGFβ1誘導的同時，沉默組蛋白去甲基化酶KDM4A的表達，Snail1甲基化程度發(fā)生改變，抑制了EMT的進程，前列腺癌PC3細胞由間質(zhì)形轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ば螒B(tài)（圖9），間質(zhì)marker Snail1表達下調(diào)（圖10）。

圖8 前列腺良性增生和前列腺癌組織免疫組化結(jié)果Figure 8 Immunohistochemical results of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer

圖9 沉默KDM4A后PC3細胞形態(tài)學變化（40×）Figure 9 Morphological changes of PC3 cells after silencing KDM4A

圖10 沉默KDM4A后Snail1表達變化Figure 10 Changes of Snail1 expression after silencing KDM4A

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移與表觀遺傳修飾密切相關(guān)，重要修飾包括組蛋白甲基化、泛素化、乙?；腿旧|(zhì)重塑［8］。EMT發(fā)生期間，上皮標志物E-cadherin啟動子區(qū)域高甲基化是一例常見的表觀遺傳修飾事件［9］，可引發(fā)E-鈣粘蛋白沉默。一些報道也稱EMT其它相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug等啟動子區(qū)域甲基化與其表達相關(guān)［10］，可能主要因EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、ZEB1和ZEB2能夠募集HDAC復合物，發(fā)生EMT時使E-cadherin表達沉默［11］。

目前，組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的重要領(lǐng)域［12］，其中以組蛋白H3各位點的乙酰化，甲基化及泛素化等最為常見和多變［13］。相關(guān)報道指出組蛋白H3各位點乙?；揎椧话憔腿旧|(zhì)的開放程度有關(guān)，H3乙?；梢哉T導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，促進基因轉(zhuǎn)錄，而甲基化修飾的結(jié)果則取決于基因組的不同功能［14-15］。組蛋白H3甲基化中H3 K4和H3K36甲基化修飾可激活基因轉(zhuǎn)錄，H3K9甲基化可導致特殊染色質(zhì)的形成，抑制基因轉(zhuǎn)錄。有研究證實H3K9ME3基因上游和基因組富集與染色質(zhì)開放和基因轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)［16-17］，本課題的研究結(jié)論與其一致。

賴氨酸甲基化是調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種常見組蛋白修飾。癌癥發(fā)展進程中，組蛋白賴氨酸甲基化顯著改變，被認為是由不受控制的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶或組蛋白去甲基化酶作用的結(jié)果［18-19］。KDM4 是一種組蛋白去甲基酶［20］，主要針對賴氨酸9/36位置上的組蛋白H3和賴氨酸26位置上的組蛋白H1.4［21］。有研究證明KDM4A、KDM4B和（或）KDM4C在乳腺、結(jié)直腸、口腔［22］、甲狀腺［23］、肺及前列腺等腫瘤中均呈現(xiàn)過表達，它們是腫瘤細胞迅速生長所必需的去甲基化酶，這可能是由于其具備調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達的作用，如雄激素和雌激素受體。本課題通過沉默KDM4A，探索轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達的改變，證實了通過干擾組蛋白修飾的變化可以阻滯EMT的發(fā)展進程。不僅為臨床提供了新的前列腺癌診斷依據(jù)，也為該疾病的靶向治療開辟了新局面。