余學高 鄧間開 陳耀銘 陳培松 何小洪 鐘良英 黃彬

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起。全球約有3.6億HBV感染者，每年約有100萬人死于與HBV相關的肝臟疾?。?］。我國屬于HBV感染的高發(fā)區(qū)，現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬例［1］。拉米夫定（lamivudine，LAM）是一種有效的抗病毒藥物，用于治療慢性乙型肝炎和晚期肝病患者［2-3］。然而，長期的拉米夫定單藥治療導致了抗拉米夫定乙型肝炎病毒的出現(xiàn)，治療1年后，16%～55%的患者出現(xiàn)了病毒突破［4-5］。LAM抗性主要與HBV聚合酶基因的酪氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸（tyrosine-methionine-aspartate-aspartate，YMDD）基序204位突變有關。常見突變是甲硫氨酸變?yōu)槔i氨酸（reverse transcriptase methionine 204 valine，rtM204V）或異亮氨酸（reverse transcriptase methionine 204 isoleucine，rtM204I）［6-7］。病毒學突破與丙氨酸轉氨酶升高分別發(fā)生在YMDD突變出現(xiàn)后的2～28周和12～31 周［8-10］。因此，早期檢測耐 LAM 突變及進行治療監(jiān)測，將有助于醫(yī)生為慢乙肝患者制訂個性化治療方案。本研究中，我們建立了乙型肝炎病毒YMDD突變的下一代測序檢測方法，并對該方法進行性能評價，以期為臨床檢測乙型肝炎病毒耐藥基因提供新手段。

1 材料與方法

1.1 樣本

選取2017年1月至12月間在中山大學附屬第一醫(yī)院接受LAM單藥治療至少3個月的乙型肝炎病毒感染患者，用無菌分離膠管采集患者外周血5 mL，3 500 rpm離心5 min，分離的血清樣本用于臨床常規(guī)HBV DNA熒光定量PCR檢測，HBV DNA大于100 IU/mL的患者入組，共229例，其中男性182例，女性47例。年齡17～77歲，平均年齡（46.1±13.63）歲。將入組患者血清轉移到無菌低吸附Eppendort管內(nèi)，凍存于-80℃冰箱備用。

1.2 儀器與試劑

ABI 9700 PCR 儀（LOT N8050200）、磁力架（LOT 4314）、One Touch2儀器（LOT 2457881-5247）、ES儀器（LOT 74200）、DA8600下一代測序儀（LOT sn247560288）、ABI 3500 DX基因分析儀（LOT 4406019）、Qubit 3.0熒光定量 儀（LOT 2321609904）等儀器均購自美國Life Technology公司，核酸提取試劑盒（LOT#DA-Z14648）購自中山大學達安基因股份有限公司，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（LOT B518141-0100）購自上海生物工程有限公司，Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0（LOT 4480441）、Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit（LOT A26434）、Ion PITMHi-QTMSequencing 200 kit（LOT 4488315）、Qubit?dsDNA HS Assay kit（LOT 1788710）試劑均購自美國Life Technology公司。

1.3 方法

1.3.1 下一代測序法檢測YMDD突變

1.3.1.1 樣本核酸提取 采用核酸提取試劑盒（離心柱法）提取血清標本中的DNA，按照試劑盒說明書進行操作，使用Qubit 3.0熒光定量儀進行核酸定量。提取后的DNA保存于-20℃。

1.3.1.2 病毒DNA擴增及純化 采用定性PCR方法對HBV P基因區(qū)進行擴增并靶向捕獲。根據(jù)HBV P基因區(qū)設計引物（引物序列見表1），PCR擴增條件如下：95℃預變性15 min；然后94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸45 s，共 40個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。采用上海生物工程有限公司的SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR擴增產(chǎn)物，用Qubit 3.0熒光定量儀對純化后的核酸定量。純化后的DNA置于-20℃保存。

表1 PCR擴增的目的區(qū)域引物序列Table 1 Primer sequence of target region for PCR amplification

1.3.1.3 文庫構建 嚴格按照文庫構建試劑盒說明書對純化后的PCR產(chǎn)物進行文庫構建：①末端補平：按要求配制末端補平反應液進行反應；②產(chǎn)物純化：對末端補平后的產(chǎn)物進行磁珠純化；③連接接頭：按要求分別加相應接頭；④產(chǎn)物純化：對連接接頭產(chǎn)物進行磁珠純化；⑤擴增文庫：按要求配制反應體系進行文庫擴增；⑥產(chǎn)物純化：對擴增文庫產(chǎn)物進行磁珠純化；⑦文庫定量：采用Qubit 3.0熒光定量儀對文庫核酸定量。構建好的文庫置于-20℃保存。

1.3.1.4 模板制備和模板富集 構建好的DNA文庫經(jīng)過稀釋后使用Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit（Life Technologies公司，美國）試劑盒，在One Touch2儀器及ES儀器（Life Technologies公司，美國）上嚴格按照說明書操作，進行模板的制備和富集。

1.3.1.5 DA8600測序儀測序 使用Ion PITMHi-QTMSequencing 200 kit（Life Technologies 公司，美國）試劑盒，嚴格按照說明書操作，對上一步實驗收集到的混合文庫樣本進行下一代測序。

1.3.1.6 結果分析 運用生物信息學分析系統(tǒng)，運行 variantCaller插件，在“Allele Call”項目下，顯示為“Absent”或“No Call”，則對應的突變點無突變即為YMDD型。在“Allele Call”項目下，顯示為“Heterozygous”或“Homozygous”，則對應的突變位點有突變，判定為對應突變類別（YVDD或YIDD），詳見表2。

表2 YMDD突變類別Table 2 Mutation category of YMDD

1.3.2 Sanger測序

使用中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒耐藥基因突變檢測試劑盒（PCR-測序法）（國食藥監(jiān)械（準）字2014第3401444號），嚴格按照試劑盒說明書檢測并分析結果。具體操作流程：①核酸提?。菏褂煤怂崽崛≡噭┖校x心柱法）；②PCR試劑準備：按要求準備PCR擴增體系試劑；③加樣；④PCR擴增：按下列條件擴增：50℃2 min，95℃ 15 min預變性，然后 94℃變性 30 s，55℃復性 30 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)；最后72℃延伸7 min；⑤產(chǎn)物純化：按要求進行產(chǎn)物純化；⑥測序PCR：按要求配制測序PCR體系，按下列條件擴增：96℃1 min預變性，然后96℃變性10 s，50℃復性5 s，60℃延伸4 min，共25個循環(huán)；最后4℃保溫；⑦測序產(chǎn)物純化：按要求參照BigDye?Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit用戶手冊進行純化；⑧ABI 3500 DX基因分析儀測序：按要求上機測序；⑨結果分析：運行SeqScanner程序，分析結果。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS軟件進行方法學比較的數(shù)據(jù)分析，Kappa（κ）系數(shù)檢驗進行方法學比較的一致性分析。P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成功建立下一代測序法檢測YMDD突變的方法

在229份慢乙肝樣本中，下一代測序法檢測到 44例rtM204V突變，25例rtM204I突變，5例rtM204V/I混合突變。

2.2 下一代測序法檢測YMDD突變的方法學評價

下一代測序法和Sanger測序法均在229份慢乙肝樣本中檢測到74例YMDD突變。其中Sanger測序法檢測到47例rtM204V突變、25例rtM204I突變和2例rtM204V/I混合突變。下一代測序法的靈敏度100%，特異度100%，準確度100%。2種測序方法檢測到的突變類型完全符合率為95.95%（71/74），部分符合率為4.05%（3/74），未發(fā)現(xiàn)完全不一致（0/74，0%）（圖 1）。下一代測序法檢測到 3例Sanger測序法漏檢的rtM204V/I混合突變。

圖1 下一代測序法與Sanger測序法檢測YMDD突變的結果比較Figure 1 The comparison of next generation sequencing method and Sanger sequencing method

2.3 下一代測序法的重復性

根據(jù)Sanger測序法的結果，選取5例基因突變陽性的樣本（包含YIDD突變2例，YVDD突變3例）、2例基因突變陰性樣本，采用下一代測序法對所選樣本進行重復檢測，每天上機檢測一次，連續(xù)重復檢測10天。經(jīng)重復性試驗檢測，下一代測序法的檢測結果均一致，重復性符合率為100%。

2.4 下一代測序法與Sanger測序法的方法學比較

下一代測序法與Sanger測序法的方法學比較結果見表3，2種方法檢測YMDD突變的一致性好（Kappa=0.97，P＜0.01）。

表3 下一代測序法與Sanger測序法檢測YMDD突變的比較Table 3 The comparison of the next generation sequencing and Sanger sequencing for detection of YMDD mutations

2.5 3例檢測結果不一致的分析

下一代測序法與Sanger測序法有3例樣本的檢測結果不一致，Sanger測序法均只檢出YVDD突變，而下一代測序法檢出YVDD/YIDD混合突變。這3例患者均為高齡，男性，2例肝硬化，1例肝癌，均為長期用藥患者，HBV DNA載量在103～105IU/mL（見表 4）。

表4 下一代測序法與Sanger測序法3例檢測結果不一致的分析Table 4 Analysis of inconsistent results between next generation sequencing and Sanger sequencing

3 討論

HBV感染主要的治療方法是抗病毒治療，國內(nèi)外普遍使用的藥物有干擾素和核苷（酸）類似物。由于干擾素需要反復注射，且副作用較多，近年來，核苷（酸）類似物（nucleoside acid analogues，NA）已成為抗HBV感染的主要方法之一。NA因其抑制病毒復制能力強、使用方便、耐受性好且療效確切，適用于不同階段的乙肝患者，是長期治療的合理選擇［11-13］。乙肝患者在長期治療中常常對藥物出現(xiàn)耐受的情況，是因為HBV是高變異的病毒，在患者接受抗病毒藥物治療時，病毒自身受生存壓力而導致變異［1］。拉米夫定是第一個被批準用于治療慢性乙型肝炎的核苷類似物，能顯著降低HBV DNA水平，并可使患者肝功能恢復正常和肝臟組織學改善。HBV YMDD變異對拉米夫定用藥產(chǎn)生影響，基因組變異為 rt180、rt204 和 rt207［14-16］。目前比較明確與耐藥相關的變異主要是HBV聚合酶RT區(qū)YMDD基因序列的變異（rt204），發(fā)生YVDD或者YIDD變異，導致HBV野生株中蛋氨酸被纈氨酸或異亮氨酸替代。當HBV出現(xiàn)耐藥株后，大量復制，嚴重影響治療的效果［17］。因此需要監(jiān)測乙型肝炎病毒耐藥基因型，有助于臨床判斷治療效果和制定個性化抗病毒治療方案。

目前常用的檢測HBV耐藥基因的方法主要有PCR產(chǎn)物直接測序法（即Sanger測序法）、克隆測序法、基因芯片法、PCR-熒光探針法和斑點雜交等方法，不同檢測技術的特異性及靈敏度有一定的差異，Sanger測序法被認為是檢測DNA變異的金標準，但由于靈敏度較低限制了其應用。該方法只在特定突變達20%以上時才能檢測出。克隆測序法可大致確定不同毒株序列之間的相對比例，有助于發(fā)現(xiàn)混合株，但是操作繁瑣且靈敏度有限。此外，基因芯片法、PCR-熒光探針法和斑點雜交法在臨床上均有使用，針對每一個位點分別設計探針或引物，靈敏度各不相同，都只能檢測已知的耐藥突變位點，效率低下［18-19］。

下一代測序技術是能在單次反應中同時檢測來自數(shù)千或數(shù)百萬DNA模板上堿基序列的DNA測序技術。該技術具有高數(shù)據(jù)通量、短序列讀長等特征。目前下一代測序平臺主要有基于熒光檢測的illumina測序平臺和基于質(zhì)子檢測的Life半導體測序平臺。隨著測序成本的下降，下一代測序技術越來越多地用于疾病研究和診斷治療中［20-21］。

本研究建立了下一代測序法檢測乙型肝炎病毒YMDD突變的方法，并對所建方法進行了評價。下一代測序法對229例臨床樣本的檢測結果顯示，YMDD基因突變陽性率為32.31%（74/229），比宋世會等［22］和張笠等［23］報道的高，可能是本研究著重選取長期拉米夫定單藥治療患者和地域差異導致。Sanger測序法檢測到47例rtM204V突變、25例rtM204I突變和2例rtM204V/I混合突變。下一代測序方法檢出44例rtM204V突變，25例rtM204I突變和5例rtM204V/I混合突變。下一代測序法的靈敏度為100%，特異度100%，準確度100%，完全符合率為95.95%（71/74），部分符合率為4.05%（3/74），未發(fā)現(xiàn)完全不一致（0/74 0%）。通過重復性實驗下一代測序法的重復性符合率100%。2種方法的一致性（κ）為 0.97（P＜0.01）。其中有3例樣本在Sanger測序法只檢出rtM204V突變，在下一代測序法中檢出rtM204V/I混合突變。結果提示下一代測序法的檢測靈敏度高于Sanger測序法，能檢測到Sanger測序法漏檢的混合突變。Sanger測序法只能在突變比例大于20%時檢出性能好，結果僅代表優(yōu)勢序列的信息，無法早期發(fā)現(xiàn)耐藥突變。本研究不足之處在于由于實驗條件限制并沒有做克隆測序進一步驗證3例不一致樣本。

本研究成功建立了乙型肝炎病毒YMDD突變的下一代測序法。該方法靈敏度高，特異性好，重復性好，準確性高，比Sanger測序法更靈敏，能檢測到更多的混合突變，為乙型肝炎病毒耐藥基因檢測提供了新的手段，同時為其他病原體耐藥基因的檢測提供了新思路。隨著下一代測序技術發(fā)展，操作自動化程度越來越高，測序成本越來越低，能更好地應用于臨床檢測。