呂永楠，王京偉

擴(kuò)張型心肌病(DCM)是以左心室擴(kuò)大伴心功能下降為主要特征的心肌病，目前認(rèn)為35%的擴(kuò)張型心肌病與基因突變有關(guān)[1]。心內(nèi)膜纖維彈性組織增生是罕見的心肌結(jié)構(gòu)紊亂，常發(fā)生于嬰兒或年輕患者，預(yù)后差[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)X染色體或常染色體遺傳是導(dǎo)致心內(nèi)膜纖維彈性組織增生的可能病因[3]。Nebulin蛋白是一組肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它結(jié)合了單個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基，并參與了原肌鈣蛋白的組裝[4]。在心肌中特異表達(dá)Nebulin家族蛋白的是Nebulette(NEBL)基因，參與了心肌組織的早期發(fā)生及構(gòu)成肌纖維組織[5-6]，NEBL基因多態(tài)性與非家族性擴(kuò)張型心肌病有關(guān)[7]。本研究對(duì)1例年輕擴(kuò)張型心肌病患者進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)其NEBL基因突變，并對(duì)其家系成員進(jìn)行了基因篩查，為早期篩查和干預(yù)擴(kuò)張型心肌病提供候選基因，并進(jìn)一步提示NEBL基因突變與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)性。

1 臨床資料

患者，男，23歲，患者近1個(gè)月以來反復(fù)感冒，活動(dòng)后自覺胸悶喘氣不適，伴有乏力、心慌，活動(dòng)耐量較前明顯下降，患者于外院給予抗感染治療后癥狀緩解不明顯，近1周患者自覺上述癥狀加重，伴夜間不能平臥入睡。查體：T 36.5 ℃，R 18次/min，P 82次/min，BP 124/82 mmHg。神清，精神可，全身皮膚黏膜未見出血點(diǎn)、黃染，全身淺表淋巴結(jié)未及腫大，頸靜脈無怒張，頸軟，雙肺呼吸音清，右下肺可聞及濕啰音。HR 82次/min，律齊，未聞及明顯雜音。腹平軟，無壓痛及反跳痛，肝脾肋下未及，雙腎區(qū)無叩痛，雙下肢無水腫。心臟超聲檢查：LAD 45 mm，LVDD 63 mm，RAD 40 mm，RVD 23 mm，LVEF 37%。NT-proBNP 6 732 ng/L。

經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，先證者及其家屬成員均知情同意并簽署知情同意書，然后進(jìn)行血液標(biāo)本收集，相關(guān)操作均符合倫理委員會(huì)要求和赫爾辛基宣言。詳細(xì)詢問先證者及其家屬成員病史、家族史，根據(jù)患者描述，制作患者家系系譜圖，對(duì)先證者進(jìn)行體格檢查、血液指標(biāo)、心臟超聲和心電圖等檢查，對(duì)家族成員行心臟超聲檢查。由武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心對(duì)先證者候選致病基因全外顯子高通量測序，獲得可疑突變后，利用Sanger測序驗(yàn)證家系成員是否存在可疑突變。

Ⅰ2 和Ⅰ3死亡原因不明，Ⅱ2是先證者父親，心臟超聲檢查：LAD 32 mm，LVDD 46 mm，RAD 36 mm，RVD 38 mm，LVEF 60%。Ⅱ3是先證者母親，心臟超聲檢查：LAD 30 mm，LVDD 43 mm，RAD 38 mm，RVD 33 mm，LVEF 70%。Ⅲ2是先證者弟弟，年齡13歲，目前未發(fā)病。Ⅰ1、Ⅰ4、Ⅱ1、Ⅱ4目前體健，未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病，見圖1。

注：□正常男性；○正常女性；■已故男性死因不明；●已故女性死因不明；患病男性；→先證者

圖1 先證者及其家系圖

候選基因篩查結(jié)果：實(shí)驗(yàn)室對(duì)受檢者外周血提取基因組DNA采用Life technologies公司Ion PGM高通量測序儀檢測ACTN2，LMNA，NEXN，PCSK9，PSEN2，TNNT2，TWIK-1，ANKRD1，BAG3，LDB3，MYPN，NEBL，RBM20，VCL，CRYAB，CSRP3，MYBPC3，MYL2，PKP2等65個(gè)遺傳性心肌病相關(guān)基因，并使用Ion Reporter數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，受檢者共發(fā)現(xiàn)525個(gè)變異，通過分析ClinVar數(shù)據(jù)庫、UCSC數(shù)據(jù)庫Common SNPs、dbSNP數(shù)據(jù)庫及1000-genome-project MAF小于等于1%的罕見突變，濾除無功能的同義突變和內(nèi)含子突變，發(fā)現(xiàn)5個(gè)候選有害或可能有害突變位點(diǎn)進(jìn)行OMIM數(shù)據(jù)庫檢索、HGMD數(shù)據(jù)庫檢索及PubMed數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)分析，初步認(rèn)為NEBL基因的p.Ser429Leu變異，GATAD1基因的p.Thr71fs變異，與受檢者擴(kuò)張型心肌病關(guān)系可能性最大。經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證，NEBL基因的p.Ser429Leu變異為真性變異, GATAD1基因的p.Thr71fs變異為假性變異，見表1。

家系成員Sanger測序結(jié)果：根據(jù)先證者候選基因篩查結(jié)果，對(duì)獲取的家族人員血液標(biāo)本進(jìn)行NEBL c.1286C>T(p.Ser429Leu)測序，結(jié)果提示Ⅱ2和Ⅱ3是突變基因攜帶者，見圖2。

圖2 Sanger法序列驗(yàn)證先證者和家系成員結(jié)果

2 討 論

擴(kuò)張型心肌病的遺傳模式主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，但少部分也存在其他遺傳模式如常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳和線粒體DNA遺傳。其中約75%的擴(kuò)張型心肌病患者都集中在TTN、MYH7、MYBPC3、LMNA、SCN5A、TNNT2、TNNI3、MYH6和PLN等基因[8-10]。但本研究通過基因測序發(fā)現(xiàn)，本例年輕擴(kuò)張型心肌病患者存在NEBL基因突變，是較為罕見的致病基因。

表1 先證者基因突變結(jié)果

目前研究發(fā)現(xiàn)心肌病患者中編碼心肌結(jié)構(gòu)蛋白基因突變，尤其是編碼細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白，包括Z盤蛋白，可能是導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病發(fā)生最終的共同通路[11]。NEBL是肌小節(jié)Z盤蛋白，通過與肌動(dòng)蛋白和原肌鈣蛋白復(fù)合物相互作用從而參與心肌機(jī)械傳感和心肌收縮。因此，NEBL基因突變是擴(kuò)張型心肌病致病基因之一。

Purevjav等[12]研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病患者中NEBL基因突變(K60N、Q128R、G202R和A592E)中發(fā)現(xiàn)肌小節(jié)和Z盤表達(dá)異常，會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列心臟表型和不同的疾病嚴(yán)重程度，以及不同程度的心臟功能損害的臨床表現(xiàn)。

Maiellaro-Rafferty等[13]研究證實(shí)，在NEBL轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物試驗(yàn)中，NEBL基因突變是心肌結(jié)構(gòu)和機(jī)械改變導(dǎo)致心肌動(dòng)力學(xué)改變的早期標(biāo)志。研究還發(fā)現(xiàn)處于潛伏期的小鼠DCM模型，NEBL基因突變導(dǎo)致肌鈣蛋白表達(dá)和定位異常，會(huì)顯著影響鈣離子調(diào)控和機(jī)械壓力反應(yīng)。

本研究中發(fā)現(xiàn)先證者存在NEBL基因突變，突變位點(diǎn)位于 c.1286C>T(p.Ser429Leu)?；颊甙Y狀、實(shí)驗(yàn)室檢查和心臟超聲均提示DCM伴有心功能不全，NEBL基因c.1286C>T(p.Ser429Leu)突變?yōu)殄e(cuò)義突變，先證者、Ⅱ2和Ⅱ3均是此基因的攜帶者，但是Ⅱ2和Ⅱ3目前無明顯癥狀，心臟超聲檢查未發(fā)現(xiàn)心臟腔室結(jié)構(gòu)異常和功能下降，可能為遺傳異質(zhì)性導(dǎo)致，但是相關(guān)研究提示NEBL基因突變具有潛在發(fā)展為DCM可能性，對(duì)于Ⅱ2和Ⅱ3應(yīng)該定期行心臟超聲檢查或心臟MR檢查評(píng)估心臟腔室結(jié)構(gòu)，以利于早期干預(yù)患者，延緩病情進(jìn)展。

遺傳因素在DCM病理發(fā)展過程中起到重要的作用，特別是年輕患者，從基因水平尋找DCM發(fā)病機(jī)制具有重要的意義，能夠早期輔助臨床診斷疾病，并預(yù)測該患者臨床預(yù)后，制定個(gè)體化診療方案，將為基因診斷和治療DCM開辟新的途徑。但是目前臨床實(shí)踐中，基因檢測仍然面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，如基因型和表型之間的差異，隨著新一代基因檢測技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳的研究將有助于明確基因型和表型之間的關(guān)系。