崔欣萍，馮佳卉，趙春穎，趙 晴，趙 碩，劉金欣、2△

（1.承德醫(yī)學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000；2.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所）

金蓮花(Trollius chinensisBge.)是毛茛科金蓮花亞科多年生草本植物的干燥花及花蕾[1]。金蓮花味微苦、性寒、無毒，具有清熱解毒、滋補陰氣、清熱降火、抗菌消炎、養(yǎng)陰清熱、消炎殺菌等功效[2]。金蓮花以花入藥，其形態(tài)受氣候環(huán)境等多種因素影響，采用傳統(tǒng)鑒定方法具有一定局限性。DNA條形碼技術(shù)是基于遺傳物質(zhì)DNA對物種進行鑒定，不受生長環(huán)境、地理位置及人為因素的影響。本研究嘗試建立一種基于ITS2序列的DNA條形碼鑒定方法，以期為中藥材金蓮花的鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究共收集11份來自河北、山西、東北等地的金蓮花樣品，產(chǎn)地信息見附表：

附表 金蓮花樣品產(chǎn)地信息

1.2 金蓮花DNA的提取、PCR擴增及測序 每份樣品取一朵干凈無霉斑的完整花朵進行取樣，每份取樣30mg，利用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取總DNA。PCR擴增使用植物DNA條形碼ITS2序列通用引物和程序，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI 3730XL測序儀進行雙向序列測定。依據(jù)《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》對測序峰圖質(zhì)量進行判斷。

1.3 數(shù)據(jù)分析 利用CodonCode Aligner V7.0.1軟件去除測序結(jié)果的低質(zhì)量部分，并進行峰圖的校對拼接，獲得ITS2間隔區(qū)序列；基于隱馬爾可夫模型[3](hidden Markov model )對數(shù)據(jù)進行分析，利用Hmmer V3.1軟件去除5.8S區(qū)段和28S區(qū)段獲得ITS2序列；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，進行物種鑒定。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花樣品DNA提取結(jié)果 為考察DNA提取方法的穩(wěn)定性，對編號為JLH07和JLH09的樣品做了三次重復試驗，共提取了15份樣品的DNA。采用NanoDrop2000c型超微量分光光度計測量DNA濃度，DNA濃度平均值為186.59ng/μl，A260/A280值在1.93～2.10之間，A260/A230值在0.85～1.44之間。所有金蓮花樣品均成功提取DNA，且獲得的DNA純度較高。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果 通過電泳及凝膠成像檢測PCR產(chǎn)物，所有樣品均可檢測到明亮、清晰的條帶，產(chǎn)物大小為480bp。電泳及凝膠圖譜見圖1：

圖1 金蓮花樣品的電泳及凝膠圖譜

2.3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 通過MEGA7.0軟件構(gòu)建NJ樹（見圖2）。將金蓮花和淡紫金蓮花的標準序列加入到NJ樹中后，發(fā)現(xiàn)所有樣品共分為兩支，其中樣品編號JLH05和JLHZ08單獨聚為一支，與淡紫金蓮花序列一致，其余序列與金蓮花的序列一致。說明，基于ITS2的DNA條形碼可以準確鑒定金蓮花與淡紫金蓮花。

圖2 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

中藥品種繁多且混雜，加之大多以根莖葉花等部位局部入藥，沒有完整的植物形態(tài)，故依靠傳統(tǒng)的鑒定方法對藥材進行鑒定有一定的局限性。2010年，陳士林等[4]提出將ITS2作為藥用植物通用條形碼，進而發(fā)現(xiàn)其能對物種進行快速有效地鑒別?，F(xiàn)如今，基于ITS2序列的DNA條形碼技術(shù)已在蕓香科[5]、傘形科[6]等多種科屬的藥用植物物種鑒定方面得到廣泛應用。徐曉蘭等[7]進行了山豆根基原植物及其混偽品的鑒定，結(jié)果表明ITS2序列可以很好地鑒定山豆根基原植物；石林春等[8]進行了天南星及其混偽品的鑒定，結(jié)果表明ITS2序列可以有效地鑒定天南星3種基原及其混偽品。上述研究結(jié)果均提示，ITS2序列在中藥材鑒定方面有一定的優(yōu)越性，為中藥材的鑒定及用藥安全等提供了有力支持。

本研究收集了11份金蓮花樣品，采用DNA條形碼技術(shù)進行鑒定研究，分析獲得的ITS2序列和NJ樹，發(fā)現(xiàn)有9份樣品為金蓮花，2份樣品為淡紫金蓮花。本研究證明，基于ITS2的DNA條形碼技術(shù)可以準確有效地鑒別金蓮花，可為中藥材金蓮花的鑒定提供參考依據(jù)。