燕 磊，李潔平，趙震焱

（鄭州市第二人民醫(yī)院，河南鄭州 450006）

Rh血型系統(tǒng)基因由R H C E基因、RHD基因組成，位于人類(lèi)染色體1p34.3-1p36.1短臂上，是當(dāng)前已知的血型系統(tǒng)中除ABO血型以外的具較強(qiáng)免疫原性的血型，并具復(fù)雜多態(tài)性[1]。Rh缺失型D是Rh血型系統(tǒng)中極為罕見(jiàn)的基因變異型，其紅細(xì)胞表面僅有D抗原表達(dá)，C抗原、c抗原、E抗原、e抗原表達(dá)均缺失[2]。在輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，Rh缺失型D--的個(gè)體若被Rh抗原致敏可產(chǎn)生多種Rh抗體針對(duì)C抗原、c抗原、E抗原或e抗原，因此發(fā)生嚴(yán)重溶血性輸血反應(yīng)[3]。當(dāng)前，關(guān)于Rh缺失型D--的臨床報(bào)道多為Rh缺失型D--孕婦個(gè)體引起的胎兒或新生兒溶血性疾病[4-5]；并且，當(dāng)前國(guó)內(nèi)關(guān)于Rh缺失型D--表型的研究多為個(gè)案報(bào)道[6]。鑒于此，本研究鑒定分析了本院收治的Rh缺失型D--個(gè)體及家庭成員的血清學(xué)及遺傳背景，旨在為中國(guó)人群的血型基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性等研究積累更多的臨床資料。

1 資料與方法

1.1 病例資料 研究對(duì)象為2018年11月在本院分娩后大出血需輸血的產(chǎn)婦1名。該名產(chǎn)婦年齡29歲，既往有輸血史，孕2胎產(chǎn)2胎。2014年分娩1胎，女?huà)?，健康成活?018年12月分娩1胎，男嬰，男嬰產(chǎn)后進(jìn)行性皮膚黃疸加重。男性新生兒實(shí)驗(yàn)室檢查紅細(xì)胞計(jì)數(shù)1.24×1012/L，Hb 56g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞比值0.35，有核紅細(xì)胞140個(gè)/100個(gè)白細(xì)胞，血清總膽紅素260.36μmol/L，臨床初診新生兒溶血病(hemolytic disease newborn，HDN)。為查明男嬰發(fā)生HDN的原因、為產(chǎn)婦提供相配的血液輸注，采集產(chǎn)婦及其家屬（其夫、患兒、其女、其母、其姐、其兄、其妹，未采集到其父標(biāo)本）血液標(biāo)本進(jìn)行交叉配血檢查，標(biāo)本送達(dá)時(shí)患兒已因病情過(guò)重死亡。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞及試劑：IgM型單克隆抗-A、抗-B、抗-D血清及抗人球蛋白試劑、篩選細(xì)胞，均購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限公司；反定型紅細(xì)胞，購(gòu)自長(zhǎng)春博德生物醫(yī)藥有限公司；譜細(xì)胞、IgM型單克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清，購(gòu)自美國(guó)IMMUCOR公司；人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清自制；基因組DNA提取試劑盒、PCR-SSPCDE試劑盒，均購(gòu)自德國(guó)Inno-train公司；引物均為上海生物工程公司合成；直接抗人球蛋白試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)z卡購(gòu)自西班牙Grifols公司。

1.2.2 血型鑒定：獲得研究對(duì)象知情同意后采集5ml空腹肘靜脈血，制備5%紅細(xì)胞懸液。試管法鑒定ABO血型、Rh血型，對(duì)IgM型單克隆抗-C、抗-c、抗-E、抗-e初篩顯示C、c、E或e抗原陰性的標(biāo)本再次用人源抗-C、抗-c、抗-E、抗-e血清進(jìn)行吸收放散實(shí)驗(yàn)，明確被檢紅細(xì)胞上有無(wú)對(duì)應(yīng)抗原；直接抗人球蛋白試驗(yàn)DAT實(shí)驗(yàn)?zāi)z卡對(duì)樣本進(jìn)行直接抗人球蛋白（DAT）試驗(yàn)。

1.2.3 基因型分析：嚴(yán)格參照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取產(chǎn)婦及其家庭成員EDTA抗凝全血中的基因組DNA，調(diào)整濃度至50ng/μ l。參照PCR-SSPCDE試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)產(chǎn)婦及其家庭成員RHD基因第1（PCR產(chǎn)物大小124bp，檢測(cè)基因D1）、2（149305bp，D2、C、D3）、3（139bp，D4）、4（152303bp，D5、psi）、5（130bp，D6）、6（122bp，D7）、7（186bp，D9）、8（147bp，D10）、9（106298bp，C、“W”）、10（145bp，c）外顯子，以及RHCE基因特征性片段11（157bp，E）、12（155bp，e）、13（166107124bp，D1Ⅶ、DHMi）、14（166165bp，D1Ⅶ、DAU）、15（139135bp，DNB、697A）、16（139133bp，DNB、697C）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：雙蒸水6μl、引物混合物3 μl、Taq酶0.08μl，DNA 1 μl。反應(yīng)條件：94℃ 20min 1個(gè)循環(huán)；94℃ 20s、70℃ 60s，5個(gè)循環(huán)；94℃20s、65℃ 60s、72℃ 45s，10個(gè)循環(huán)；94℃ 20s、61℃ 50s、72℃45s，20個(gè)循環(huán)；72℃ 5min ，1個(gè)循環(huán)；10℃保存PCR產(chǎn)物。取10 μ l PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣于含0.7μg/ml EtBr的2%瓊脂糖凝膠，電泳20min，8～10V，凝膠成像系統(tǒng)紫外光下拍照記錄，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)均含434bp內(nèi)對(duì)照物，電泳后所有陰性反應(yīng)管出現(xiàn)該對(duì)照帶。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)婦及其家庭成員血型鑒定結(jié)果 產(chǎn)婦、其丈夫、患兒、其女、其母、其姐、其兄ABO血型鑒定結(jié)果顯示均為A型血，其妹為AB型；Rh血型見(jiàn)表1：

表1 被檢對(duì)象血型鑒定結(jié)果

2.2 產(chǎn)婦及患兒的DAT實(shí)驗(yàn)及抗人球蛋白試驗(yàn) 產(chǎn)婦DAT實(shí)驗(yàn)陰性，患兒DAT實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性（++）?？贵w鑒定顯示產(chǎn)婦、患兒血清與譜細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中均不凝集，為陰性。產(chǎn)婦抗人球蛋白試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性，在抗人球蛋白試驗(yàn)中與所有細(xì)胞均發(fā)生強(qiáng)凝集（+++），產(chǎn)婦自身對(duì)照無(wú)凝集。

2.3 產(chǎn)婦及其家庭成員的RHD基因分型 產(chǎn)婦及其家庭成員PCR結(jié)果證實(shí)，產(chǎn)婦RHD基因未見(jiàn)異常，亦未檢出RHCE基因的特異性序列；其他家庭成員均有正常表型及RHCE基因產(chǎn)物，且產(chǎn)婦及其家庭成員PCR結(jié)果與血型學(xué)表型基因相符。見(jiàn)表2-3、附圖。

表2 PCR-SSP CDE檢測(cè)試劑盒PCR產(chǎn)物及檢測(cè)基因

表3 產(chǎn)婦及其家庭成員的RHD基因分型

附圖 產(chǎn)婦及其家庭成員的RHD基因分析圖

3 討論

本研究病例個(gè)體及家族成員血型鑒定結(jié)果顯示，產(chǎn)婦、其夫、其子的ABO血型均為A型，可明確排除母嬰ABO血型不合引起的HDN；并且，產(chǎn)婦Rh血型為D--，存在C、c、E、e抗原缺失現(xiàn)象，其夫及兩子女Rh血型均為D+C+c-E-e+，均有C、e抗原。且結(jié)果顯示產(chǎn)婦DAT實(shí)驗(yàn)陰性，患兒DAT實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性（++）；抗體鑒定陰性；產(chǎn)婦抗人球蛋白試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性，抗人球蛋白試驗(yàn)中與所有細(xì)胞均發(fā)生強(qiáng)凝集（+++），產(chǎn)婦自身對(duì)照無(wú)凝集。因此，可以排除產(chǎn)婦存在自身抗體。該產(chǎn)婦既往有妊娠及輸血史，且既往有研究報(bào)道Rh缺失型D--個(gè)體通過(guò)妊娠、輸血或可產(chǎn)生抗抗-Rh17抗體，即針對(duì)Rh高頻率抗原的抗體，結(jié)合患兒HDN實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，證實(shí)HDN是免疫學(xué)原因所致。因此，類(lèi)Rh缺失型D--血液中存在針對(duì)高頻抗原的抗體，與一般紅細(xì)胞均可發(fā)生凝集反應(yīng)，僅與RHD--、Rhnull、Rhmod細(xì)胞不反應(yīng)，因此，尋找相配血液供產(chǎn)婦輸注相當(dāng)困難。這也是本研究采集其家系血清的重要原因，但在產(chǎn)婦家系中并未發(fā)現(xiàn)Rh缺失型D--個(gè)體。

既往有研究指出[7-8]，Rh缺失型D--多因近親婚配導(dǎo)致，但對(duì)本研究中產(chǎn)婦家系進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，該產(chǎn)婦并無(wú)明顯證據(jù)證實(shí)其Rh缺失型D--是近親婚配所致。但基于血清學(xué)檢查的局限性，許多Rh缺失型D--血清學(xué)檢測(cè)為純合子，但分子生物學(xué)方法檢測(cè)卻為雜合狀態(tài)，且?guī)缀跛械腞h缺失型D--均至少有一條順式雜合單倍體[9-10]。為此，本研究進(jìn)一步采用PCR-SSP技術(shù)分析了產(chǎn)婦及其家庭成員的RHD和RHCE基因。結(jié)果顯示，產(chǎn)婦及其家庭成員的PCR-SSP結(jié)果與血型學(xué)表型基本符合，RHD基因9個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亦均顯示為正常RHD基因，并未見(jiàn)RHCE基因插入、互換現(xiàn)象；產(chǎn)婦RHCE基因特異性序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析顯示未見(jiàn)RHCE基因特異性序列，提示產(chǎn)婦的RHCE基因極有可能大部分或全部缺失，但其他家庭成員則均有正常RHCE基因表型及RHCE基因PCR產(chǎn)物；同時(shí)，PCR產(chǎn)物分析結(jié)果還顯示其母、其兄皆出現(xiàn)Dpsi條帶，與產(chǎn)婦及其姐妹的PCR產(chǎn)物結(jié)果矛盾，不能從遺傳學(xué)角度解釋?zhuān)紤]PCR假陽(yáng)性。

綜上所述，產(chǎn)婦其母、其兄、其姐、其妹及其子、其女均有正常RHCE基因表型，而產(chǎn)婦未見(jiàn)RHCE基因，分析Rh缺失型D--的原因或可能為產(chǎn)婦父母分別攜帶一條D--單倍型，為RHCE基因缺失型雜合狀態(tài)，遺傳時(shí)將D--單倍型遺傳給產(chǎn)婦所致。擬在今后的研究中檢測(cè)該產(chǎn)婦家庭成員的RHD基因、RHCE基因缺失型雜合狀態(tài)，并對(duì)產(chǎn)婦cDNA作RHCE基因全長(zhǎng)測(cè)序，以深入探究。