黃艷潔，袁亞男，李 璐，許 倩，鄭紀(jì)寧

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

大腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高。2018年，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，全球范圍內(nèi)大腸癌的發(fā)病率位于第四位，死亡率位于第二位[1]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，大腸癌的發(fā)生發(fā)展與微小RNA（microRNA，miR）有關(guān)。microRNA是一類非編碼小分子單鏈RNA，通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。其中的miR-15a可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等，并在多種腫瘤中低表達(dá)，如骨肉瘤[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]等，但目前miR-15a-5p與大腸癌的關(guān)系尚不清楚。多藥耐藥基因1(multidrug resistancegene1，MDR1)與腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)，其編碼的P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)可通過(guò)ATP釋放的能量將細(xì)胞內(nèi)藥物泵至細(xì)胞外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，導(dǎo)致化療效果下降[5]。有研究發(fā)現(xiàn)[6]，miR-15a-5p可能對(duì)MDR1有調(diào)控作用，但大腸癌組織中miR-15a-5p與MDR1關(guān)系的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究檢測(cè)了大腸癌組織中miR-15a-5p與MDR1的表達(dá)情況，并分析了大腸癌組織中二者的相關(guān)性，以期為大腸癌的臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 2017年10月-2019年3月，在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及承德市中心醫(yī)院行大腸癌根治術(shù)的大腸癌患者44例。入選標(biāo)準(zhǔn)：均行手術(shù)治療；行手術(shù)治療前均未進(jìn)行放化療或其它輔助治療；病歷資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：非原發(fā)性大腸癌；存在其它部位腫瘤。

每例標(biāo)本均包括大腸癌組織，以及對(duì)應(yīng)的距離腫瘤邊緣超過(guò)5cm的癌旁正常腸黏膜組織，且所有患者均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查確診。44例患者中，男21例，女23例；年齡38～75歲，中位年齡65歲；組織分化程度：高、中分化34例，低、未分化10例；腫瘤浸潤(rùn)深度：未浸透漿膜層16例，浸透漿膜層28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期31例。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及承德市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

1.2 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取液氮保存的大腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織，置于經(jīng)DEPC水處理的勻漿器中，加入1ml Trizol冰上充分勻漿，常規(guī)提取組織總RNA，經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280為1.8～2.1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)加樣量體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取總RNA 2μg，miR-15a-5p按照Tiangen miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit試劑盒說(shuō)明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，MDR1 mRNA按照Tiangen FastQuant cDNA試劑盒說(shuō)明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。熒光定量PCR采用SYBR Green法，miR-15a-5p擴(kuò)增用miRcute Plus miRNA qPCR Kit試劑盒，MDR1 mRNA擴(kuò)增用SuperReal PreMix Plus試劑盒。反應(yīng)體系共20μl。miR-15a-5p反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min后，94℃ 20s、60℃ 34s，共44個(gè)循環(huán)；MDR1 mRNA反應(yīng)條件：95℃ 60s，1個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 15s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad公司CFX96型Real-time PCR儀檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，檢測(cè)miR-15a-5p表達(dá)以U6為內(nèi)參，檢測(cè)MDR1 mRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參。

引物序列：miR-15a-5p上游引物5’-UAGCAGCACA UAAUGGUUUGUG-3’，下游引物為試劑盒中通用引物；U6上游引物5'-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3'，下游引物5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；MDR1上游引物5'-GGAGCCTACTTGGTGGCACATAA-3'，下游引物5'-TGGCATAGTCAGGAGCAAATGAA-3'；GAPDH上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物 5'-TGGTGAAGACGCCAGT-3'。

計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，復(fù)孔間Ct值差異≤0.5，否則重復(fù)該樣本實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo) 分析大腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織miR-15a-5p mRNA與MDR1 mRNA的表達(dá)情況，大腸癌組織中miR-15a-5p mRNA表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，以及miR-15a-5p、MDR1 mRNA表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，配對(duì)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon檢驗(yàn)方法，兩組樣本比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)方法。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織miR-15a-5p、MDR1 mRNA表達(dá)比較 以U6為內(nèi)參，miR-15a-5p在大腸癌組織中的表達(dá)量為0.51（0.25），明顯低于癌旁正常腸黏膜組織[1.17（2.95）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；以GAPDH為內(nèi)參，MDR1 mRNA在大腸癌組織中的表達(dá)量為2.21（4.07），明顯高于癌旁正常腸黏膜組織[1.13（2.28）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 大腸癌組織miR-15a-5p表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，大腸癌組織miR-15a-5p表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.343，P＜0.05）。

2.3 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系 miR-15a-5p表達(dá)與性別、年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05)：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移，III～I(xiàn)V期明顯低于I～I(xiàn)I期。MDR1 mRNA表達(dá)與性別、年齡、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P＞0.05)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05)：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移，III～I(xiàn)V期明顯高于I～I(xiàn)I期。見(jiàn)附表：

附表 miR-15a-5p、MDR1 mRNA表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

大腸癌是高發(fā)病率、高死亡率的惡性腫瘤之一?；熥鳛闇p少進(jìn)展期大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要手段，在臨床治療中起著重要作用，但腫瘤多藥耐藥性的產(chǎn)生常常會(huì)導(dǎo)致化療失敗，嚴(yán)重影響大腸癌的治療效果。因此，克服多藥耐藥、提高腫瘤對(duì)化療的敏感性，對(duì)臨床治療大腸癌具有重要意義。

miR-15a-5p是miR-15家族的成員，位于人類染色體13q14區(qū)，近年研究表明其可以通過(guò)靶向結(jié)合多種編碼基因mRNA的3＇UTR，抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)靶mRNA的降解，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及多藥耐藥。GUO等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a在胰腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)顯著降低，并且可通過(guò)下調(diào)耐藥相關(guān)因子Bmi-1抑制腫瘤細(xì)胞增殖及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；BOZOK等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a在非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；另外，miR-15a還可以調(diào)控與凋亡有關(guān)的原癌基因(Bcl-2)、與細(xì)胞周期有關(guān)的基因(Cyclin D1，CyclinE，C-myb，CDCA4)等多個(gè)下游靶基因發(fā)揮抑癌作用[9-10]。上述研究均表明，miR-15a可作為抑癌基因參與某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展并與腫瘤耐藥關(guān)系密切。本研究檢測(cè)了大腸癌及癌旁正常腸黏膜組織中miR-15a-5p的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大腸癌組織miR-15a-5p的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常腸黏膜組織，提示miR-15a-5p可能作為抑癌基因參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分析不同臨床病理特征的大腸癌組織miR-15a-5p的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、TNM分期III～I(xiàn)V期的明顯低于I～I(xiàn)I期者，提示miR-15a-5p可能與大腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，miR-15a-5p可能作為判斷大腸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)指標(biāo)用于臨床。

MDR1基因編碼的跨膜糖蛋白P-gp，是經(jīng)典的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，能利用ATP水解釋放的能量將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物，如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、阿霉素等泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度降低，從而表現(xiàn)為對(duì)化療藥物的耐藥[11]。大量研究表明，P-gp在多種惡性腫瘤如胃癌、肺癌及乳腺癌中均有較高表達(dá)，并且P-gp的高表達(dá)是多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要原因之一[12]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大腸癌及癌旁正常腸黏膜組織中MDR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在大腸癌中MDR1的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常腸黏膜組織，提示在大腸癌組織中MDR1基因的轉(zhuǎn)錄處于明顯激活狀態(tài)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相符[13]。分析MDR1與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示大腸癌的多藥耐藥與腫瘤轉(zhuǎn)移可能有某種內(nèi)在聯(lián)系[12]；另外，TNM分期III～I(xiàn)V期的大腸癌患者M(jìn)DR1的相對(duì)表達(dá)量明顯高于I～I(xiàn)I期者，說(shuō)明MDR1高表達(dá)可能促進(jìn)大腸癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織miR-15a-5p與MDR1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在大腸癌組織中miR-15a-5p可能通過(guò)抑制MDR1負(fù)向調(diào)控P-gp的表達(dá)從而影響大腸癌多藥耐藥。

綜上所述，大腸癌中miR-15a-5p的表達(dá)水平降低、MDR1的表達(dá)水平升高，二者均與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，且大腸癌中二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明二者均可能參與了大腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但本研究樣本量較少，且僅從組織水平進(jìn)行了觀察，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并從細(xì)胞水平進(jìn)行具體機(jī)制的研究。