劉 揚(yáng),梁智慧,孫淑珍,田中偉,戴廷波

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部作物生理生態(tài)與生產(chǎn)管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210095; 2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000;3.江蘇省淮安市淮安區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,江蘇淮安 223200)

傳統(tǒng)評定作物品種抗逆性的方法多以產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)，但其周期較長，受環(huán)境影響較大。萌發(fā)期是作物生長發(fā)育的基礎(chǔ)階段，也是產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時期。在萌發(fā)和萌發(fā)后苗期室內(nèi)鑒定品種的抗逆性差異不僅可以有效控制外界環(huán)境因素，還具有時間短，容量大，重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究擬通過水培試驗(yàn)方法，篩選適宜的小麥種子萌發(fā)高銨脅迫臨界濃度，并在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)評價不同小麥品種對高銨脅迫響應(yīng)的差異，為小麥耐高銨基因型的篩選及其生化機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

1.1.1 高銨脅迫臨界濃度的篩選

1.1.2 高銨脅迫臨界濃度點(diǎn)驗(yàn)證

1.1.3 抗高銨脅迫品種的篩選

以篩選的高銨脅迫臨界濃度于2013年9月和11月進(jìn)行耐高銨品種篩選試驗(yàn)。供試材料為不同年代育成的24個小麥品種，包括：南大2419、火燒頭、小偃4號、江東門、豐產(chǎn)3號、揚(yáng)麥1號、豫麥13、寧麥13、揚(yáng)麥13、寧麥9號、煙農(nóng)19、豫麥49、鄭麥9023、揚(yáng)麥11、揚(yáng)麥158、鎮(zhèn)麥9523、蘇麥6號、徐州25、魯麥15、矮抗58、淮麥25、金禾9123、揚(yáng)麥16 。水培容器為塑料紗網(wǎng)特制的培養(yǎng)周轉(zhuǎn)箱(310×210×110 mm)，選取籽粒飽滿、均勻的小麥種子，用20% H2O2浸泡10 min，蒸餾水沖洗干凈后，置于距周轉(zhuǎn)箱底部6 cm紗網(wǎng)上，于光暗比12 h/12 h(24/16 ℃)培養(yǎng)。分別用850 mL含篩選的高銨脅迫臨界濃度和對照(CON)的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，其離子成分與1.1.1相同。每個處理設(shè)4個重復(fù)，每天更換一次營養(yǎng)液，并用1.0 mM NaOH調(diào)pH至 6.8～7.0。處理7 d后取樣，測定形態(tài)指標(biāo)。

1.2 測試項(xiàng)目與方法

1.2.1 植株形態(tài)及干重測定

處理7 d后，取20顆發(fā)芽的種子，分別測定胚根和胚芽鞘長度后，將其分為胚芽鞘、根系和種子剩余物三部分，105 ℃殺青30 min，70 ℃ 烘干至恒重，計算不同部位的干物質(zhì)量。

1.2.2 主要貯藏物質(zhì)含量和α-淀粉酶活性測定

稱取1.2.1中烘干樣品0.1 g，加8.0 mL 80% 的乙醇于10 mL離心管中，搖勻；80 ℃ 水浴30 min，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于25 mL容量瓶中，乙醇提取重復(fù)3次，定容至25 mL；可溶性糖含量采用蒽酮法[12]測定；游離氨基酸含量采用Moore方法[13]測定；總淀粉含量和α-淀粉酶活性分別采用茚三酮比色法[14]和3,5-二硝基水楊酸法[15]測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用耐銨指數(shù)[16]衡量不同基因型的耐高銨性。

耐銨指數(shù) = 高銨脅迫下的測定值/硝處理下的測定值。

數(shù)據(jù)采用EXCEL和SPSS 10.0進(jìn)行分析；圖表采用Sigmaplot 10.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥高銨脅迫臨界濃度的篩選

隨著銨濃度的升高，種子發(fā)芽率、胚根長度、根數(shù)、株高、胚芽鞘和胚根干重逐漸下降(表1)。與CON相比，銨濃度 <5.0 mM各處理的種子發(fā)芽率、株高和胚芽鞘干重雖下降，但無顯著性差異；銨濃度>5.0 mM各處理的被測指標(biāo)均與CON差異顯著。因此，確定高銨脅迫臨界濃度為5.0 mM。由表2可知，與CON相比，5.0 mM銨脅迫下，株高和胚芽鞘干重降低幅度遠(yuǎn)小于胚根長度和干重降低幅度，說明根系對高銨脅迫更敏感。

表1 不同銨濃度處理對小麥種子萌發(fā)的形態(tài)學(xué)影響

同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different small letters following data in same column mean significant difference among treatments at 0.05 level.The same in tables 2 and 5.

表2 高銨脅迫對小麥種子萌發(fā)的形態(tài)學(xué)影響

2.2 高銨脅迫對小麥萌發(fā)相關(guān)生理指標(biāo)的影響

隨著萌發(fā)時間的延長，銨脅迫與CON處理揚(yáng)麥13萌發(fā)種子內(nèi)α-淀粉酶活性趨勢不盡相同，前3 d均上升且處理間差異不顯著；萌發(fā)3 d后，高銨脅迫較CON處理顯著降低了揚(yáng)麥13萌發(fā)種子內(nèi)α-淀粉酶活性。隨著萌發(fā)時間的推進(jìn)，萌發(fā)種子內(nèi)淀粉含量逐漸下降，在萌發(fā)3 d后，高銨脅迫處理的種子內(nèi)淀粉含量顯著高于CON處理。種子內(nèi)可溶性糖隨萌發(fā)時間推移呈先升后降趨勢，在第5天和第7天時，處理間差異達(dá)到顯著水平，游離氨基酸含量隨著萌發(fā)時間的推進(jìn)逐漸增加，在萌發(fā)第7天時差異顯著(圖1)。

* 表示兩種處理間在P<0.05水平差異顯著。

* means significant difference between treatments at 0.05 level.

圖1 高銨脅迫對小麥種子萌發(fā)貯藏物質(zhì)動員的影響

Fig.1 Effect of elevated ammonium nutrition on storage matter mobilization during wheat seed germination

2.3 高銨脅迫對小麥萌發(fā)相關(guān)形態(tài)指標(biāo)的影響

由表3可知，銨脅迫與CON處理間，6個形態(tài)指標(biāo)的差異均達(dá)到極顯著水平。兩種氮形態(tài)下，胚根干重、胚芽鞘干重、植株干重和根冠比均具有較大變異(變異系數(shù) > 10%)。與CON處理相比，EAN處理提高了小麥的胚根長度、胚根干重和根冠比變異系數(shù)，說明根系對高銨脅迫更加敏感。

表3 不同處理下小麥種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)的差異

同行數(shù)據(jù)后不同的大寫字母表示兩種處理間差異在P<0.01水平顯著。

Values followed by different capital letter mean significant difference between treatments at 0.01 level.

2.4 小麥耐高銨基因型篩選

將6個指標(biāo)的耐銨指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析表明，胚根長度耐銨指數(shù)與胚芽鞘長度耐銨指數(shù)的相關(guān)性達(dá)到顯著水平；胚根干重耐銨指數(shù)與植株干重耐銨指數(shù)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與根冠比耐銨指數(shù)呈顯著相關(guān)；胚芽鞘長度耐銨指數(shù)與胚根干重、根冠比耐銨指數(shù)的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與植株干重耐銨指數(shù)呈顯著相關(guān)；胚芽鞘干重耐銨指數(shù)與植株干重和根冠比耐銨指數(shù)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(表4)。以胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比耐銨指數(shù)為指標(biāo)，經(jīng)歸一化處理后采用離差平方和法進(jìn)行聚類分析(圖2)。將24個小麥品種劃分為三類：高銨敏感型、中間型和耐高銨型。其中，高銨敏感型品種以火燒頭、鎮(zhèn)麥9523，魯麥15等品種為代表；中間型以寧麥9號、小偃4號、南大2419等品種為代表；耐高銨型以豫麥49品種為代表。進(jìn)一步分析表明，除根冠比耐銨指數(shù)在中間型和耐高銨型類群中差異不顯著外，其他指標(biāo)在三個類群中差異均顯著(表5)。綜上，在高銨脅迫濃度為5.0 mM條件下，可以將胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比作為耐高銨脅迫基因型的篩選指標(biāo)。

表4 小麥不同指標(biāo)耐銨指數(shù)的相關(guān)性

RCL:胚芽鞘長度耐銨指數(shù); RRL:胚根長度耐銨指數(shù); RRDW:胚根干重耐銨指數(shù);RCDW:胚芽鞘干重耐銨指數(shù);RRSDW:剩余種子干重耐銨指數(shù);RPDW:植株干重耐銨指數(shù); RRSR:根冠比耐銨指數(shù)。下同。

RCL:Resistance ammonium index of coleoptile length;RRL:Resistance ammonium index of radicle length; RRDW:Resistance ammonium index of radicle dry weight;RCDW:Resistance ammonium index of coleoptile dry weight; RRSDW:Resistance ammonium index of remaining seed dry weight; RPDW:Resistance ammonium index of plant dry weight; RRSR:Resistance ammonium index of root/shoot ratio.The same in table 5.

圖2 24個小麥品種的系統(tǒng)聚類圖

表5 耐高銨脅迫的類群間差異

Table 5 Difference between two clusters in elevated ammonium nutrition tolerance indices

類型 TypeRRLRCLRRDWRCDWRPDWRRSR耐高銨型Resistance0.575a0.967a0.779a0.974a0.921a0.893a中間型Moderate0.508b0.921b0.710b0.885b0.876b0.848b高銨敏感型 Sensitivity0.447c0.881c0.622c0.820c0.804c0.834b

3 討論與小結(jié)

3.1 高銨脅迫臨界濃度的確定

植物生長受環(huán)境因子影響與限制，當(dāng)某種因子超出植物生長所能承受的范圍時，會對植物產(chǎn)生脅迫作用。銨是植物生長的重要氮源之一，是參與植物生理生化過程的重要離子。隨著銨濃度的升高，植物受脅迫程度加劇。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度銨(≤0.05mM)對植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用，而高濃度銨(5.0mM)抑制植物生長，表現(xiàn)在抑制種子萌發(fā)，降低根系生長速率和葉面積、葉片含水量和光合速率[5,7,17-19]，與本研究結(jié)果一致。在擬南芥不同突變體對銨營養(yǎng)響應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥在1.0 mM 和5.0 mM銨濃度下，初生根生長速率顯著降低，與硝態(tài)氮相比，5.0 mM銨水平抑制效果顯著[20-21]。本研究中，與硝態(tài)氮相比，5.0 mM銨濃度顯著降低了小麥萌發(fā)期發(fā)芽率、胚根長度、株高、胚芽鞘干重和胚根干重、萌發(fā)種子內(nèi)α-淀粉酶活性、可溶性糖和游離氨基酸含量，增加了小麥萌發(fā)種子內(nèi)淀粉含量，且此濃度下種子萌發(fā)階段被測形態(tài)和生理指標(biāo)(第5天開始)均與對照差異達(dá)到顯著，證明5.0 mM為小麥萌發(fā)的高銨脅迫臨界濃度。

3.2 小麥耐高銨脅迫基因型篩選

植物品種對氮素營養(yǎng)響應(yīng)的差異研究始于20世紀(jì)30年代，Schortemeyer等[22]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型玉米幼苗對20 mM銨的響應(yīng)存在基因型差異。此外，在玉米、高粱、水稻、棉花、大豆和黑麥等作物上也均有這方面報道[23-24]。不同品種小麥自身存在基因型差異，本研究采用了耐銨指數(shù)(相對值)衡量不同小麥品種對銨的響應(yīng)，以消除環(huán)境干擾以及品種自身生物性狀的差異。

已有較多高銨脅迫對作物幼苗生長影響的研究[20,25-26]，但大部分集中在擬南芥突變體材料以及不同物種間的比較。本研究對6個萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)耐性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析表明，胚根長度耐銨指數(shù)與胚芽鞘長度耐銨指數(shù)的相關(guān)性達(dá)到顯著水平；胚根干重耐銨指數(shù)與植株干重耐銨指數(shù)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與根冠比耐銨指數(shù)呈顯著相關(guān)；胚芽鞘長度耐銨指數(shù)與胚根干重、根冠比耐銨指數(shù)的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與植株干重耐銨指數(shù)呈顯著相關(guān)；胚芽鞘干重耐銨指數(shù)與植株干重和根冠比耐銨指數(shù)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。因此，建議以胚根長度、胚芽鞘長度、植株干重和根冠比耐銨指數(shù)作為小麥種子萌發(fā)時期耐高銨基因型的篩選指標(biāo)。通過聚類分析將24個供試小麥品種劃分為三類：高銨敏感型、中間型和耐高銨型。高銨敏感型和耐銨型間的6個被測指標(biāo)間均呈現(xiàn)顯著性差異。高銨敏感型品種以火燒頭、鎮(zhèn)麥9523和魯麥15為代表；耐高銨型品種以豫麥49為代表。篩選出的耐高銨品種可以在以后的抗銨育種中作為種質(zhì)材料加以應(yīng)用。