顧艷

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院 江蘇南京210000）

1 前言

食品檢測(cè)行業(yè)中對(duì)食品過(guò)敏原檢測(cè)的方法有3種，分別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫吸附法具有敏感性強(qiáng)、特異性高和實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)通量較低，在檢測(cè)時(shí)很容易受到其他因素的影響，如抗原-抗體反應(yīng)不完全、抗體種類(lèi)限制等，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度大大降低[1]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)，同樣也會(huì)受到各種因素的影響，無(wú)法檢測(cè)復(fù)雜食品基質(zhì)中的過(guò)敏原；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法具有高通量、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用在食物過(guò)敏原蛋白質(zhì)檢測(cè)中[2]。目前，在嬰幼兒食品過(guò)敏原蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)中，仍缺乏高準(zhǔn)確度和高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。本文使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)，對(duì)嬰幼兒食品中過(guò)敏原成分進(jìn)行檢測(cè)分析。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 儀器與設(shè)備

超聲破碎儀、真空濃縮儀、LC-3000 高效液相質(zhì)譜儀、3000 Purifier 色譜系統(tǒng)，所使用到的儀器都定期進(jìn)行校準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果參考性價(jià)值高。

2.1.2 材料與試劑

為了確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性，本次實(shí)驗(yàn)選擇靈敏度高、穩(wěn)定性好的過(guò)敏原蛋白質(zhì)特征肽段。堅(jiān)果類(lèi)選擇VGFNTNSLK 和QGQVLTIPQNFAVAK；雞蛋類(lèi)選擇YPILPEYLQCVK；黃豆類(lèi)選擇SQSDN FEYVSFK；魚(yú)類(lèi)選擇SGFILEEDELK；花生類(lèi)選擇GTGN-LELVAVR；牛奶類(lèi)選擇FALPQYLK。

牛胰蛋白酶、FA、IAA、DTT、EDTA、Tris、Triton X-100、尿素、甲醇、ACN、BCA 試劑盒、C18 硅膠填料、超濾離心管；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)過(guò)純化處理。

2.2 方法

2.2.1 樣品提取

使用i-FASP 方法、原位過(guò)濾輔助樣品預(yù)處理、膜上原位樣品預(yù)處理方法等方法提取樣品1[3]。取樣品粉末0.1 g，加入1.5 mL C12Im-CI 離子液體，然后利用超聲破碎儀提取液，取上清液，并檢測(cè)其中蛋白質(zhì)的濃度，檢測(cè)方法使用BCA 檢測(cè)，最后對(duì)上清液進(jìn)行保存?zhèn)溆?，保存溫度?80℃。

使用丙酮沉淀法提取樣品2[4]。取樣品粉末0.1 g，加入1.5 mL 提取液，振蕩混勻，對(duì)樣品進(jìn)行超聲和離心，然后同樣取上清液，并計(jì)算出上清液的體積，接著加入冰丙酮溶液，使冰丙酮含量是上清液體積的4 倍，再進(jìn)行靜置，靜置時(shí)間2 h，靜置溫度-20℃，再對(duì)其進(jìn)行離心，最后取出沉淀物，沉淀物需要使用冰丙酮洗滌兩次，待晾干后使用碳酸氫銨溶液進(jìn)行溶解，并使用BCA 檢測(cè)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，最后對(duì)樣品進(jìn)行保存?zhèn)溆?，保存條件為-80℃。

2.2.2 蛋白質(zhì)酶解

（1）樣品加入到潤(rùn)濕后的超濾離心管內(nèi)，對(duì)其進(jìn)行離心處理；（2）在膜上加入200 μL DTT 溶液，進(jìn)行變性處理，變性時(shí)間為5 min，溫度為95℃，進(jìn)行離心處理；（3）加入200 μL 的碳酸氫銨溶液（規(guī)格為10 mmol/L）進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行離心處理；（4）向膜上加20 μg 蛋白酶、45 μL 的碳酸氫銨溶液（規(guī)格為10 mmol/L）和5 μL 100 mmol/L IAA 溶液，將樣品放置在溫度為37℃地方進(jìn)行自然反應(yīng)，時(shí)間為12 h，隨后進(jìn)行離心處理，然后取出50 μL 的清液；（5）向膜中加入50 μL 水沖洗（水必須要進(jìn)行去離子處理），進(jìn)行離心處理，取出50 μL 的清液；（6）使用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法技術(shù)分析所得酶解液[5]。以上步驟中的離心處理都是14 000 r/min 離心20 min。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和現(xiàn)象關(guān)系確認(rèn)

為了進(jìn)一步確認(rèn)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和各個(gè)肽段的線性范圍的準(zhǔn)確度，通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)的曲線進(jìn)行確認(rèn)[6]。線性方程以Y=AX+B表示，通過(guò)線性方程確認(rèn)線性關(guān)系，經(jīng)過(guò)3 次以上的分析發(fā)現(xiàn)相差較小，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性越高，6 種過(guò)敏原蛋白質(zhì)的現(xiàn)象范圍詳見(jiàn)表1。定量限值以測(cè)量濃度范圍的最小值為準(zhǔn)。

表1 6 種過(guò)敏原蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)特征肽段的線性范圍與定量限

由表1 線性范圍最小值可知，此方法具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性。

3.2 實(shí)際樣品過(guò)敏原蛋白檢測(cè)

為了進(jìn)一步確認(rèn)本次研究方法的適用性和可靠性，選擇生活中常見(jiàn)的嬰兒面包和餅干各2 種進(jìn)行確認(rèn)，過(guò)敏原檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 PRM 法檢測(cè)實(shí)際嬰幼兒食品中6 種過(guò)敏原蛋白質(zhì)的含量

由表2 可知，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際商品成分標(biāo)識(shí)基本相符，說(shuō)明本次檢測(cè)方法具有一定的實(shí)用性和可靠性。

4 結(jié)語(yǔ)

基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，使用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)，能夠有效檢測(cè)出嬰兒食品中過(guò)敏原蛋白質(zhì)。相對(duì)于其他過(guò)敏原檢測(cè)法，該檢測(cè)方法具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性，為嬰幼兒食品安全提供了保障，同時(shí)也在一定程度上彌補(bǔ)了我國(guó)食品過(guò)敏原檢測(cè)方法的不足，為食品過(guò)敏原標(biāo)簽管理提供了技術(shù)支持。另外，必須要選擇適當(dāng)?shù)臉悠诽崛》椒?，篩選優(yōu)化平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件，從而滿足高通量、高準(zhǔn)確度的檢測(cè)需求。