王敏
天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700
安捷倫1200高效液相色譜儀,VWD檢測(cè)器。
對(duì)甲苯磺酸甲酯對(duì)照品,純度98%;對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品,純度98%。上述對(duì)照品均為SIGMA-ALDRICH。色譜甲醇、色譜乙腈均為Fisher公司,試驗(yàn)用水為超純水。
色譜柱為ACE 3C18柱(150×4.0mm,3μm);流動(dòng)相以0.02mol/L磷酸氫二鉀(磷酸調(diào)節(jié)PH至6.5)-乙腈=7:3為流動(dòng)相A,乙腈:甲醇=2:1為流動(dòng)相B,梯度洗脫(0~42min,100%A;42~45min,A100% → 29%;45~55min,29%A;55~75min,100%A)流速1.0ml/min;檢測(cè)波長225nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量100μl??瞻兹軇?0%乙腈溶液。
對(duì)照溶液的制備:精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯適量,用50%乙腈溶解并制成每ml含對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備:精密稱取樣品適量,用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液。
檢測(cè)限:精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60mg同置100ml量瓶中,用50%乙腈溶解并定容至刻度;再精密移取0.1ml置100ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液42μl置5ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為對(duì)甲苯磺酸甲酯的檢測(cè)限溶液;取儲(chǔ)備液83μl置5ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為對(duì)甲苯磺酸乙酯的檢測(cè)限溶液。分別精密量取上述檢測(cè)限溶液各100μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,色譜圖主峰峰高約為基線噪音的3倍。
結(jié)果表明,當(dāng)供試品濃度為30mg/ml時(shí)(折算成進(jìn)樣量為3mg),是對(duì)甲苯磺酸甲酯最低檢測(cè)濃度的約600萬倍,是對(duì)甲苯磺酸乙酯最低檢測(cè)濃度的約280萬倍,因此供試品中大于0.0002‰的雜質(zhì)可被有效檢出,完全可以滿足檢測(cè)靈敏度的要求[1]。
定量限:取檢測(cè)限項(xiàng)下儲(chǔ)備液167μl置5ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為對(duì)甲苯磺酸甲酯的定量限溶液;取檢測(cè)限項(xiàng)下儲(chǔ)備液250μl置5ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限溶液。
分別精密量取上述定量限溶液各100μl注入液相色譜儀,色譜圖主峰峰高約為基線噪音的10倍,對(duì)甲苯磺酸甲酯定量限為2.0ng,相當(dāng)于樣品量0.0007‰;對(duì)甲苯磺酸乙酯定量限為3.2ng,相當(dāng)于樣品量0.001‰。
精密量取上述定量限溶液各100μl,連續(xù)6次進(jìn)樣,作為定量限精密度溶液,記錄色譜圖,考察連續(xù)進(jìn)樣各次的樣品峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果顯示連續(xù)6針對(duì)甲苯磺酸甲酯峰面積RSD為5.2%,對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積RSD為3.5%,定量限精密度良好。
精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中,用50%乙腈溶解并定容至刻度;再精密移取0.1ml置100ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,作為儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液 250μl、335μl、400μl、500μl、600μl、750μl、1ml分 別 置 5ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,制成一系列的線性溶液。取上述溶液各100μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,求出線性方程和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)甲苯磺酸甲酯濃度在0.03μg/ml~0.12μg/ml之間,線性方程y=337.8x+1.1484,R2=0.9994,峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。對(duì)甲苯磺酸乙酯濃度在0.03μg/ml~0.13μg/ml之間,線性方程y=346.75x-1.1931,R2=0.9994,峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。
精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各60m g同置100ml量瓶中,用50%乙腈溶解并定容至刻度;再精密移取0.1ml置100ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,再取1ml置10ml量瓶中,用50%乙腈定容至刻度,制成系統(tǒng)適用性溶液。取上述溶液100μl連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,考察連續(xù)進(jìn)樣各次的樣品峰面積,計(jì)算RSD。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)6次進(jìn)樣結(jié)果表明對(duì)甲苯磺酸甲酯6針峰面積RSD為2.1%、對(duì)甲苯磺酸乙酯6針峰面積RSD為2.3%,說明該方法系統(tǒng)適用性良好,且方法的重復(fù)性良好。
取鹽酸氯吡格雷及對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品,均按限度濃度的80%、100%和120%進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn),每個(gè)濃度配制3份樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)甲苯磺酸甲酯的加樣回收率在84~96%之間,平均回收率為 90.5%,RSD=3.7%,對(duì)甲苯磺酸乙酯的加樣回收率在96~113%之間,平均回收率為104.7%,RSD=5.8%,回收率較好。
分別考察了不同柱溫、不同檢測(cè)波長、不同流速、不同流動(dòng)相PH對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,結(jié)果如下:
正常條件:采用C18柱(150×4.0mm),以0.02mol/L磷酸氫二鉀(磷酸調(diào)節(jié)PH至6.5)-乙腈=7:3為流動(dòng)相A,乙腈:甲醇=2:1為流動(dòng)相B,檢測(cè)波長為225nm,柱溫30℃,流速1.0ml/min,進(jìn)樣量100μl,采用梯度洗脫??瞻兹軇?0%乙腈溶液。對(duì)照溶液的制備:精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯適量,用50%乙腈溶解并制成每ml含對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯各0.06μg的溶液。供試品溶液的制備:精密稱取樣品適量,用50%乙腈溶解并制成每ml含鹽酸氯吡格雷30mg的溶液[2]。
不同檢測(cè)波長:將檢測(cè)波長變更為220nm和230nm,其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檢測(cè)波長改變后,檢測(cè)結(jié)果無明顯變化,方法耐用性良好。
不同柱溫:將柱溫變更為25℃和35℃,其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柱溫改變后,對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化,但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響,方法耐用性較好。
不同流速:將流速變更為0.9ml/min和1.1ml/min,其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明流速改變后,對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化,但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響,方法耐用性較好[3]。
不同流動(dòng)相PH值:將流動(dòng)相A的0.02mol/L磷酸氫二鉀分別用磷酸調(diào)節(jié)PH至6.4和6.6在與乙腈按7:3混合,其余色譜條件同正常條件進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明流動(dòng)相PH改變后,對(duì)甲苯磺酸甲酯及對(duì)甲苯磺酸乙酯的出峰時(shí)間有所變化,但對(duì)檢測(cè)結(jié)果無明顯影響,方法耐用性較好。
基因毒性物質(zhì)是指能直接或間接損害DNA,導(dǎo)致基因突變或癌癥的物質(zhì)?;蚨拘晕镔|(zhì)對(duì)DNA的損害作用包括染色體斷裂、DNA重組、DNA復(fù)制過程中共價(jià)鍵結(jié)合或插入,也包括通過激活細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性物質(zhì)而產(chǎn)生的突變。近年來有關(guān)藥物中的基因毒性雜質(zhì)的控制得到來自于藥物監(jiān)管部門與藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)的高度重視,基于風(fēng)險(xiǎn)管理的階段化TTC控制策略,使得基因毒性雜質(zhì)的控制更趨科學(xué)合理。TTC概念的應(yīng)用允許在無任何體內(nèi)數(shù)據(jù)時(shí),在足夠的安全性基礎(chǔ)上建立雜質(zhì)控制限度。TTC概念的應(yīng)用有利于患者、企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu),使他們避免做不必要的毒理研究和安全性評(píng)估。歐洲藥典委員會(huì)認(rèn)為一個(gè)產(chǎn)品在接受市場(chǎng)監(jiān)管的時(shí)候,應(yīng)該對(duì)可能存在的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估,這是建立一個(gè)新產(chǎn)品各論的基本要求?;撬狨プ鳛橐活愝^為常見的基因毒性雜質(zhì),可以通過對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)的優(yōu)化與設(shè)計(jì)進(jìn)行有效控制,符合當(dāng)下“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念,即良好的工藝設(shè)計(jì)往往能促進(jìn)高質(zhì)量藥物的生產(chǎn),并在充分保障藥物安全性的基礎(chǔ)上盡可能減少企業(yè)的研發(fā)投入及相應(yīng)的政府監(jiān)管成本。