秦憲濤， 支慶江， 王振峰， 姜文營， 常方圓

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，據(jù)最新世界腫瘤統(tǒng)計年鑒報告顯示，2012年全球范圍內(nèi)約有170萬新發(fā)乳腺癌病例以及52萬乳腺癌死亡病例[1]。手術(shù)切除是乳腺癌優(yōu)選的根治方案，然而不少患者在診斷時已處于中高腫瘤分期，導致手術(shù)機會降低。為了使乳腺癌降期以利于手術(shù)，或變不能手術(shù)為能手術(shù)，于手術(shù)前進行全身化療以縮小腫塊并為手術(shù)做準備(即新輔助化療)越發(fā)受到臨床重視[2-3]。然而，新輔助化療同時提高了患者心臟毒性的發(fā)病風險，例如蒽環(huán)類藥物作為最常用的乳腺癌新輔助化療基礎(chǔ)藥物，可導致心肌纖維退化、心肌細胞凋亡和壞死，進而引發(fā)心臟毒性。因此，積極尋找新輔助化療心臟毒性的預(yù)測標志物是十分必要的[4]。微小核糖核酸(microRNA, miR)是一組由23個左右核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，可作為多種藥物毒性的預(yù)測標志物，其中促血管生成相關(guān)miR可能通過刺激血管生長、組織灌注和恢復(fù)，進而參與新輔助化療心臟毒性的調(diào)控，從而作為其心臟毒性發(fā)生風險的潛在標志物。然而，目前尚少見相關(guān)報道[5-7]。本研究旨在評估14個循環(huán)促血管生成miR的表達水平在新輔助化療乳腺癌患者心臟毒性風險中的預(yù)測作用，報告如下。

1 對象與方法

1.1對象 本研究屬于前瞻性隊列研究，連續(xù)納入2014年7月-2016年12月接受表柔比星/環(huán)磷酰胺序貫多西他賽(epirubicin/cyclophosphamide follow by docetaxel, EC-D)新輔助化療的女性乳腺癌患者195例，年齡(45.16±5.80)歲(29～61歲)?；颊叩捏w質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為(23.15±2.06)kg/m2，心血管疾病風險因素即吸煙、高血壓病、糖尿病、血脂異常、高尿酸血癥和慢性腎臟病的患者分別有49例(25.1%)，42例(21.5%)，10例(5.1%)，37例(19.0%)，37例(19.0%)和8例(4.1%)。ECOG評分為0，1，2分的患者分別有161例(82.6%)，31例(15.9%)和3例(1.5%)?；颊呋€期左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)為67.0%(64.0%～71.0%)，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)水平為22 pg/mL(10～52 pg/mL)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

入組標準：(1)經(jīng)過臨床、影像及病理確診為原發(fā)性乳腺癌；(2)年齡18～75歲；(3) LVEF≥55%；(4)ECOG評分≤2；(5)TNM Ⅱ～Ⅲ期且準備手術(shù)治療；(6)準備使用EC-D新輔助化療治療。排除標準：(1)轉(zhuǎn)移性乳腺癌或雙側(cè)乳腺癌；(2)骨髓、肝臟或者腎臟功能異常；(3)難以控制的高血壓?。?4)之前接受過或正在接受抗腫瘤藥物治療；(5)其他惡性實體腫瘤或者血液惡性疾病史；(6)重度感染史；(7)冠心病、心肌梗死、心衰史；(8)評估難以按照方案正常隨訪；(9)妊娠或哺乳期婦女。

1.2方法

1.2.1治療方案 根據(jù)患者的病情、意愿及臨床需要選擇EC-D新輔助化療。常規(guī)方案如下[8]：表柔比星100 mg/m2d1，環(huán)磷酰胺600 mg/m2d1，21 d為1個周期，連續(xù)4個周期；然后序貫多西他賽，75～100 mg/m2d1，21 d為1個周期，連續(xù)4個周期。如果患者的人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor, HER2)陽性，根據(jù)病情和意愿聯(lián)合曲妥珠單抗6 mg/kg治療，21 d為1個周期，在多西他賽每次治療之后使用?；颊咝螺o助化療結(jié)束后即進行手術(shù)治療，術(shù)后根據(jù)病情和臨床需要接受相應(yīng)的輔助治療，共29例(14.9%)患者聯(lián)合曲妥珠單抗治療。

1.2.2標本采集 于新輔助化療前(Cycle 0, C0)采集患者的外周血，并分離血漿以檢測促血管生成miR的表達水平和cTnI水平。

1.2.3心臟毒性評估 于C0、EC-D化療4周期結(jié)束時(C4)、多西他賽化療4周期結(jié)束時即手術(shù)前(C8)及術(shù)后3月(M3)、6月(M6)、9月(M9)、12月(M12)分別采用超聲心動圖評估患者的LVEF，評估標準參考修正的Simpson方法[9]。心臟毒性定義為LVEF水平下降到53%以下且相對于基線期(C0)下降幅度超過10%、心衰、急性冠狀動脈綜合征或重度威脅生命的心率失常[10-11]。

1.2.4促血管生成miR位點的選擇 通過文獻檢索尋找證實有促進血管生成作用的miR位點，并依據(jù)一篇大型綜述的薈萃分析總結(jié)，篩選出14個促血管生成miR作為研究位點，評估它們預(yù)測新輔助化療乳腺癌患者心臟毒性風險的可能性[7]。

1.2.5定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和免疫酶熒光檢測 依照說明書，采用Trizol(美國Invitrogen公司)提取血漿樣本總RNA，并將提取到的RNA通過PrimerScript Real-time reagent kit (日本TaKaRa公司)進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。隨后，采用KAPA SYBR?FAST qPCR Kit (美國KAPA公司)對14個促血管生成miR表達水平進行定量檢測。miR的相對表達量以U6為內(nèi)參，利用2-△△Ct方法計算。miR引物序列見表1。采用免疫酶熒光檢測試劑盒(美國Dade International Inc公司)檢測血漿cTnI的水平。

表1 miR引物序列

1.3隨訪 195例中，未完成研究20例(失訪19例，退出研究1例)，余175例完成整個研究流程。本研究按照意向性分析集(n=195)進行分析，提前退出的患者評估指標按照最后一次隨訪數(shù)據(jù)進行分析，患者平均隨訪時間為(17.0±3.0)月，中位隨訪時間為18.0月(范圍：6.0～18.0，1/4-3/4分位值18.0～18.0)。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 6.0軟件制作圖片。采用Spearman秩相關(guān)分析miR水平與cTnI水平的相關(guān)性；采用Wilcoxon符號秩和檢驗評估組內(nèi)各時間點LVEF值的差異；采用Wilcoxon秩和檢驗評估發(fā)生心臟毒性患者和未發(fā)生心臟毒性患者中血漿miR表達水平的差異；采用單元多元邏輯回歸分析影響心臟毒性發(fā)生風險的miR；采用受試者工作曲線(receiver operator characteristic curve, ROC)評估聯(lián)合miR對于心臟毒性發(fā)生風險的預(yù)測作用。P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1基線期促血管生成miR表達水平 qPCR檢測得到血漿中14個促血管生成miR的表達水平(表2)。

表2 基線期(C0)miR相對表達水平

2.2促血管生成miR表達水平與乳腺癌心臟毒性標記物cTnI的關(guān)聯(lián) Spearman檢驗顯示，血漿let-7f (r=-0.251,P<0.001)和miR-20a(r=-0.233,P=0.001)與乳腺癌心臟毒性標記物血漿cTnI水平呈現(xiàn)負相關(guān)，余12個miR與cTnI水平無關(guān)(表3)。

2.3EC-D新輔助化療乳腺癌心臟毒性事件發(fā)生率 EC-D化療后C4(P<0.001)、C8(P<0.001)時間點的LVEF相對于基線期(C0)大幅下降，隨后在M3-M12各時間點數(shù)值上有所上升，但是相對于基線期依然顯著降低。11例(5.6%)出現(xiàn)LVEF水平下降到53%以下且相對于基線期下降幅度超過10%。未出現(xiàn)心衰、急性冠狀動脈綜合征或重度威脅生命的心率失常，總體心臟毒性發(fā)生率為5.6%(圖1)。

表3 miR與cTnI水平的關(guān)聯(lián)分析

cTnI：心肌肌鈣蛋白I.

LVEF：左心室射血分數(shù). ☆：P<0.05；☆☆：P<0.01；☆☆☆：P<0.001.圖1 各隨訪點LVEF水平Fig 1 LVEF level at each follow-up points

2.4促血管生成miR與心臟毒性發(fā)生風險的關(guān)聯(lián) 血漿let-7f(圖2A,P=0.027)，miR-20a(圖2B,P=0.008)，miR-126(圖2C,P=0.009)，miR-210(圖2D,P=0.048)和miR-378(圖2E,P=0.043)表達水平在發(fā)生心臟毒性患者中均顯著降低，而其他9個miR在有心臟毒性患者和無心臟毒性患者間的表達水平未見差異(圖2F-N)。進一步采用單元和多元邏輯回歸模型評估促血管生成miR與心臟毒性發(fā)生風險的關(guān)聯(lián)(表4)，發(fā)現(xiàn)let-7f(P=0.016)，miR-20a(P=0.047)，miR-126(P=0.025)和miR-210(P=0.041)是EC-D新輔助化療乳腺癌患者心臟毒性發(fā)生低風險的獨立預(yù)測因素。

發(fā)生心臟毒性患者基線期let-7f(A)，miR-20a(B)，miR-126(C)，miR-210(D)和miR-378(E)表達水平顯著低于未發(fā)生心臟毒性患者，而其他9個miR在有心臟毒性患者和無心臟毒性患者間表達水平未見差異(F-N).圖2 14個促血管生成miR與心臟毒性發(fā)生風險的關(guān)聯(lián)Fig 2 Correlation between pro-angiogenic miR and risk of cardiac toxicity

miR位點單元邏輯回歸模型P值OR95% CI低高多元邏輯回歸模型P值OR95% CI低高let-7b0.1981.7100.7553.8730.1472.3440.7417.411let-7f0.0520.4230.1781.0060.0160.2350.0720.765miR-17-5p0.1950.4840.1621.4510.1040.2610.0521.315miR-17-3p0.8161.0850.5462.1580.4311.3910.6123.158miR-18a0.5640.8270.4341.5760.3510.6740.2951.543miR-19a0.8641.0400.6631.6320.6911.1230.6341.988miR-19b-10.8240.9280.4801.7930.2801.5850.6873.660miR-20a0.0200.3260.1270.8400.0470.3150.1010.985miR-92a0.6940.8690.4331.7460.9950.9970.4432.247miR-1260.0250.3840.1660.8870.0250.2800.0920.851miR-130a0.7010.9440.7041.2660.4330.8710.6161.231miR-2100.0790.4230.1621.1030.0410.2610.0720.948miR-2960.5200.7240.2711.9350.8631.1030.3613.372miR-3780.0890.3590.1101.1690.0970.2710.0581.264

2.5聯(lián)合let-7f，miR-20a，miR-126和miR-210對于心臟毒性發(fā)生風險的預(yù)測作用 ROC曲線分析結(jié)果表明，聯(lián)合let-7f，miR-20a，miR-126和miR-210的表達水平對于心臟毒性發(fā)生低風險有著較強的預(yù)測價值，曲線下面積(AUC)為0.887，95%CI為0.809～0.965，在最佳工作點達到敏感度77.2%，特異度90.9%(最佳工作點定義為敏感度+特異度達到最大值的點)(圖3)。

圖3 心臟毒性發(fā)生風險預(yù)測價值的ROC曲線Fig 3 ROC curve of risk prediction of cardiac toxicity

2.6亞組分析 進一步將患者分為聯(lián)合曲妥珠單抗患者(n=29)和未聯(lián)合患者(n=166)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合曲妥珠單抗患者心臟毒性發(fā)生率(4/29，13.8%)高于未聯(lián)合患者(7/166，4.2%)(P=0.062)。在聯(lián)合亞組中，心臟毒性患者基線期let-7f(P=0.013)，miR-20a(P=0.043)顯著低于無心臟毒性患者，而其他12個miR未見差異；在未聯(lián)合亞組中，心臟毒性患者基線期miR-126(P=0.021)，miR-210(P=0.018)顯著低于無心臟毒性患者，而其他12個miR未見差異。

3 討 論

EC-D方案是目前乳腺癌新輔助化療最常用的方案之一，可有效縮小腫塊并提高手術(shù)機會和效果，而由于EC-D方案中蒽環(huán)類藥物可能通過抑制線粒體呼吸、促進心肌細胞自噬和凋亡、破壞心肌細胞纖維結(jié)構(gòu)等機制誘發(fā)心臟毒性，EC-D方案的心臟毒性風險需要引起臨床的極大關(guān)注，但是目前尚缺乏能夠預(yù)測EC-D方案心臟毒性的標記物。有研究發(fā)現(xiàn)，促血管生成相關(guān)miR在調(diào)控血管生成、心肌細胞纖維化和心肌重塑等方面發(fā)揮重要作用，并且可以作為預(yù)測蒽環(huán)類藥物治療乳腺癌心臟毒性的標志物[5-7]。基于以上證據(jù)，筆者推測促血管miR可能有作為預(yù)測乳腺癌患者采用EC-D新輔助化療心臟毒性發(fā)生風險的潛能。因此本研究檢測了14個促血管生成miR的表達水平，旨在評估14個miR在新輔助化療乳腺癌患者心臟毒性風險中的預(yù)測作用。

目前，乳腺癌患者接受EC-D方案新輔助化療的心臟毒性研究主要集中在癥狀性心臟事件(例如心衰等)的發(fā)生，這種評估方法低估了其心臟毒性的實際發(fā)生風險，因此積極采用更加敏感的LVEF下降聯(lián)合評估心臟毒性的研究十分必要[12]。為了積極探尋此臨床問題，本研究評估了乳腺癌患者采用EC-D新輔助化療心臟毒性發(fā)生的風險，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟毒性發(fā)生率為5.6%，發(fā)生事件均為LVEF水平下降到53%以下且相對于基線期(C0)下降幅度超過10%，而心衰、急性冠狀動脈綜合征或重度威脅生命的心率失常事件均未發(fā)生。

為了更好地降低基于蒽環(huán)類藥物的新輔助和輔助化療方案的心臟毒性風險，眾多研究開始關(guān)注可預(yù)測蒽環(huán)類藥物心臟毒性風險的標志物，例如cTnI、N末端腦利鈉肽前體(N-terminal proB-type natriuretic peptide，NT-proBNP)等。而miR作為一類高保守性的非編碼RNA，對于蒽環(huán)類藥物化療心臟毒性的調(diào)控作用一直備受關(guān)注。一項近期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p可以通過靶向Sirt1/p66shc通路促進阿霉素導致的心臟毒性[13]。另外一項研究也發(fā)現(xiàn)，miR-320a可以通過靶向血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路加強阿霉素導致的心臟毒性[14]。此外，血漿miR-208水平在老鼠中被發(fā)現(xiàn)可以作為阿霉素導致的心臟毒性的生物標志物[15]。而另外一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中miR-1表達水平可以作為阿霉素化療治療乳腺癌導致的心臟毒性的預(yù)測標志物，且其預(yù)測價值高于cTnI水平[16]。然而，目前關(guān)于循環(huán)促血管生成miR在阿霉素治療乳腺癌患者導致心臟毒性的預(yù)測作用尚未見報道，關(guān)于其在EC-D治療乳腺癌患者心臟毒性中的作用也尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，let-7f和miR-20a與乳腺癌心臟毒性標記物cTnI均呈現(xiàn)負相關(guān)，且let-7f，miR-20a，miR-126和miR-210是EC-D新輔助化療乳腺癌較少發(fā)生心臟毒性風險的獨立預(yù)測因素，進一步ROC曲線分析顯示，聯(lián)合血漿let-7f，miR-20a，miR-126和miR-210的水平對心臟毒性風險表現(xiàn)出較高的預(yù)測價值(AUC：0.887，95%CI：0.809～0.965)。原因可能是：(1)促血管生成miR可以通過調(diào)控血管生成、心肌細胞纖維化、改善組織灌注、促進組織恢復(fù)等方面間接降低新輔助化療導致的心臟毒性[17-20]。(2)促血管生成miR可以像miR-34a-5p或miR-320a一樣發(fā)揮功能，直接調(diào)控蒽環(huán)類藥物對心肌細胞的損傷，但是這個假設(shè)還需要進一步通過基礎(chǔ)實驗證實[13-14]。

本研究尚有一些局限性：(1)本研究為單中心研究，患者主要來自于華北地區(qū)，因此存在患者選擇性偏移；(2)血漿促血管生成miR表達水平只在新輔助化療前進行了檢測，而在其他各隨訪點未檢測，因此其變化與心臟毒性的關(guān)聯(lián)未能進行評估；(3)有意義的促血管生成miR降低EC-D治療心臟毒性風險的機制需要進一步通過基礎(chǔ)實驗評估。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)let-7f，miR-20a，miR-126和miR-210水平可以作為乳腺癌患者化療低心臟毒性風險的生物標記物，這將為乳腺癌個體化治療及心臟毒性的預(yù)防提供一定依據(jù)。