何 磊，陳 欣，唐建軍

基于穩(wěn)定性同位素的有機質(zhì)分解測定在生態(tài)學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用

何 磊，陳 欣，唐建軍

（浙江大學(xué) 國家級生物實驗教學(xué)示范中心，浙江 杭州 310058）

穩(wěn)定性同位素技術(shù)是生態(tài)學(xué)的重要研究手段，該文將穩(wěn)定性同位素技術(shù)應(yīng)用于生態(tài)學(xué)開放實驗教學(xué)，設(shè)計了基于穩(wěn)定性同位素的有機質(zhì)分解測定實驗。該實驗探究性強，學(xué)生參與度高，拓寬了學(xué)生對生態(tài)學(xué)研究方法的認知，有助于學(xué)生了解穩(wěn)定性同位素技術(shù)在生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，同時大大提高了學(xué)生設(shè)計、參與相關(guān)生態(tài)學(xué)實驗的能力。

穩(wěn)定性同位素；有機質(zhì)分解；生態(tài)學(xué)實驗教學(xué)；穩(wěn)定性氮同位素；穩(wěn)定性碳同位素

土壤有機質(zhì)是一種復(fù)雜的混合物，包括單分子物質(zhì)如氨基酸、單糖等，多分子物質(zhì)如纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等，以及植物殘體和微生物殘留物等，是植物養(yǎng)分的主要來源之一[1-3]。土壤碳氮是全球碳氮循環(huán)的一個重要組成部分[4-5]，土壤所貯存的碳含量達到地球植物和大氣總和的2倍[6]，土壤中能被植物直接吸收的氮主要包括NH4+-N和NO3--N、有機氮和微生物氮等[5,7]。在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，植物同化物主要以植物凋落物（掉落的葉片以及死根）和根系分泌物的形式進入土壤，約占植物每年生產(chǎn)量的90%，成為土壤分解系統(tǒng)中有機質(zhì)的主要成分[8]。

土壤有機質(zhì)的分解受到多重因素的影響，包括該地區(qū)的氣候條件、土壤的理化性質(zhì)、植物根系分泌物，以及凋落物成分、土壤微生物群落等[9]。另外，植物的種類和多樣性也在一定程度上影響土壤有機質(zhì)的分解[10]。土壤有機質(zhì)的分解和復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程是在微生物的作用下完成的，包括礦質(zhì)化和腐殖化過程。了解土壤中有機質(zhì)分解過程，有助于了解土壤碳動力學(xué)，從而有助于研究全球碳氮循環(huán)過程[11]。

穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)是利用經(jīng)富集的稀有穩(wěn)定性同位素作為示蹤劑研究相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)問題的技術(shù)，包括生態(tài)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)、水文科學(xué)、地球科學(xué)等[3,12-13]。目前，穩(wěn)定性同位素技術(shù)已成為生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域一項重要的研究手段，其中15N和13C穩(wěn)定性同位素可以精確可靠地分析養(yǎng)分在遷移與轉(zhuǎn)化過程中的變化，因此被廣泛應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)、全球碳氮循環(huán)、農(nóng)業(yè)物種互惠等方面的研究[3,12,14-15]。

基于穩(wěn)定性同位素的有機質(zhì)分解測定，是“生態(tài)學(xué)”實驗課程中針對生態(tài)學(xué)專業(yè)本科生開設(shè)的科研訓(xùn)練實驗，具有綜合開放和注重科研思維訓(xùn)練的特點。本實驗歷時一個半月，學(xué)生通過課程學(xué)習(xí)、文獻查閱、實驗設(shè)計及操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等，完成了較為系統(tǒng)的科研基礎(chǔ)訓(xùn)練。實驗結(jié)束后，學(xué)生共享實驗數(shù)據(jù)、分組撰寫實驗報告，最終進行PPT總結(jié)匯報。該實驗有助于學(xué)生建立科學(xué)研究思維、培養(yǎng)團隊合作精神，并為日后進行相關(guān)科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗原理

1.1 15N的測定與計算[16]

15N的同位素值（δ）的計算公式如下：

其中，sample是樣本樣品的重同位素（15N）與輕同位素（14N）的豐度比；standard是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（大氣N2）的重同位素（15N）與輕同位素（14N）的豐度比，為固定值0.003 676 5。

1.2 13C的測定與計算

13C的同位素值（δ）的計算公式為：

其中，sample是樣本樣品的重同位素（13C）與輕同位素（12C）的豐度比；standard是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Pee Dee Belemnite）的重同位素（13C）與輕同位素（12C）的豐度比，為固定值0.011 237 2。

2 實驗材料與儀器設(shè)備

實驗材料包括：富集13C-15N的玉米葉片，尼龍膜25 μm，河沙（20~100目，粒徑相似）；儀器設(shè)備包括：天平及分析天平，培養(yǎng)皿，玻璃棒，藥匙，分解袋（需提前制作），橡皮筋，行星式球磨儀（飛馳，PULVERISETTE6），同位素質(zhì)譜儀（美國，Thermo Fisher Delta V Advantage），超微量電子天平（METTLER TOLEDO XP6）。

3 實驗內(nèi)容與步驟

本實驗以13C 和15N同位素雙標(biāo)記的玉米葉片作為分解材料，測定不同土壤鹽分濃度（0.5‰、2‰、5‰）下植物種植與否（有檉柳、無檉柳）對土壤中有機物（玉米葉片）分解速率的影響。實驗開始時將含有玉米葉片的尼龍網(wǎng)袋（分解袋）埋入經(jīng)不同處理的盆栽土壤中，1個月后測定分解袋中13C和15N的剩余含量。

實驗采用雙因素完全隨機實驗設(shè)計，設(shè)置3個鹽分梯度（0.5‰、2‰、5‰）和植物種植與否（有檉柳、無檉柳）2個因素，每個處理設(shè)置5個重復(fù)，所有盆栽完全隨機放置。同時設(shè)置不埋入土中的空白對照10個，共計40個分解袋。

3.1 實驗材料準(zhǔn)備

玉米種植在溫室周轉(zhuǎn)箱中，玉米拔節(jié)期后向土壤中加入15N豐度為98%的硫酸銨溶液。在孕蕙期前收獲葉片。將收獲的玉米葉片于105 ℃下殺青15 min，再移至烘箱中65 ℃烘干至恒重。由于玉米為C4植物，其葉片自然富集13C，在生長過程中不另外加富13C。

3.2 分解袋的制備

將烘干的玉米葉片混合剪成長×寬為5 mm×3 mm的碎片，并混合均勻，保證裝入每個分解袋的葉片大小、形狀、分布基本一致。準(zhǔn)確稱取0.5 g碎玉米葉片和65 ℃烘干且粒徑相似（20~100目）的過篩河沙25 g于培養(yǎng)皿中（f90 mm），并加入2 mL超純水混合均勻。用藥匙將混勻后的河沙玉米葉裝入事先備好的分解袋中（分解袋裁成14 cm×14 cm大小后制袋），壓實后用橡皮筋扎緊封口待用。將制作好的分解袋做好鹽濃度（空白對照、0.5‰、2‰、5‰）標(biāo)記和植物（空白對照、有檉柳、無檉柳）標(biāo)記。

3.3 分解袋埋放

按照分解袋上的標(biāo)記將分解袋分別埋放在對應(yīng)處理的盆栽中，一個盆栽對應(yīng)一個分解袋，并貼好標(biāo)簽。在盆栽土壤中挖掘直徑約5 cm、深約12 cm的洞，放入分解袋，分解袋頂端距離土壤表層約5 cm，再將表層土覆蓋好、壓實。其余10個空白對照分解袋不埋入土中，于–40℃以下保存待用。對埋有分解袋的盆栽每周按需澆水，保持土壤濕潤。

3.4 樣品回收預(yù)處理與上機測定

1個月后將分解袋取出，干燥至恒重。將分解袋中的剩余樣品全部取出，放入行星式球磨儀中充分研磨，然后用超微量天平稱取研磨樣品，利用同位素質(zhì)譜儀測定同位素含量。

4 實驗結(jié)果與分析

4.1 實驗結(jié)果計算

同位素測定數(shù)據(jù)見圖1，公式中數(shù)據(jù)由同位素質(zhì)譜儀直接測得。計算分解袋中重同位素的含量[16]：

計算玉米葉片的分解率（其中ck表示對照組）：

4.2 實驗結(jié)果分析

雙因素方差分析表明，種植植物顯著提高了玉米葉片的分解率（15N：F=9.43，<0.01；13C: F=4.94，<0.05），鹽濃度對葉片分解率的影響不顯著（15N：F=1.08，>0.05；13C: F=0.95，>0.05），鹽濃度與植物的交互作用對分解率的影響不顯著（15N：F=0.074，>0.05；13C: F=0.4656，>0.05）。其中，15N結(jié)果表明，種植植物對分解率的影響極顯著（<0.01），見圖2；13C結(jié)果表明，種植植物對分解率的影響顯著（<0.05），見圖3。

圖2 不同處理下玉米葉片中15N的分解率

5 結(jié)語

穩(wěn)定性同位素技術(shù)是近年來生態(tài)學(xué)科中興起的一項新型研究手段[17]，已應(yīng)用于土壤碳氮循環(huán)、生態(tài)系統(tǒng)食物鏈結(jié)構(gòu)和能量流動，以及傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中資源的互補利用等研究領(lǐng)域[3,14-15]。

圖3 不同處理下玉米葉片中13C的分解率

在生態(tài)學(xué)本科實驗中，將13C、15N同位素技術(shù)用于有機質(zhì)分解研究，探討土壤中有機物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化動態(tài)，是研究簡單的碳氮循環(huán)過程的一個良好模型。通過該實驗，學(xué)生不僅可以學(xué)習(xí)同位素質(zhì)譜儀的使用方法、樣品處理方法以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等一系列的實驗操作技能，還能更直觀地了解生態(tài)學(xué)相關(guān)設(shè)計思路及實驗方法，鍛煉實驗動手能力和生態(tài)學(xué)思維能力，為今后的科研工作打下基礎(chǔ)。該實驗需要全體學(xué)生共同參與分解袋的制作、實驗期間的管理、樣品的預(yù)處理及最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等，鍛煉了學(xué)生團結(jié)協(xié)作的能力，以及分析問題和解決問題的能力。此外，該實驗對于進一步提高學(xué)生設(shè)計生態(tài)學(xué)相關(guān)實驗?zāi)芰傲私庀嚓P(guān)生態(tài)學(xué)研究方法具有重要意義。

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Application of determination of organic matter decomposition based on stable isotope in ecological experiment teaching

HE Lei, CHEN Xin, TANG Jianjun

(National Biological Experimental Teaching Demonstration Center, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Stable isotope technology is an important research means of ecology. In this paper, the stable isotope technology is applied to the open experiment teaching of ecology, and the experiment of organic matter decomposition based on stable isotope is designed. This experiment has strong inquiry with high students’ participation, which broadens students’ understanding of ecological research methods, helps them to understand the application of stable isotope technology in the field of ecological research, and greatly improves their ability to design and participate in relevant ecological experiments.

stable isotope; organic decomposition; ecological experiment teaching; stable nitrogen isotope; stable carbon isotope

G642.423

A

1002-4956(2019)11-0174-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.11.042

2019-03-22

浙江大學(xué)通識教育改革項目（2018）；“物種多樣性維持稻田系統(tǒng)產(chǎn)量和土壤肥力穩(wěn)定性的生態(tài)學(xué)機理”國際合作項目（31661143001）；黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點實驗室開放基金項目（2016KFJJ02）

何磊（1987—），女，浙江金華，博士，實驗師，主要研究方向為生態(tài)學(xué)和實驗室管理與建設(shè)。E-mail: helei8705@zju.edu.cn