蘇來金,葉 劍,劉煥興2,徐仰麗

(1.溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江溫州 325006;2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,浙江溫州 325001)

蝦類味道鮮美,營養(yǎng)價值極高,深受我國人民喜愛。據(jù)2017中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計,2016年全國海水養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量達127萬噸,淡水養(yǎng)殖蝦產(chǎn)量達203萬噸,其中對蝦和克氏原鰲蝦的年加工量之和超過70萬噸[1]。加工過程中會產(chǎn)生約30%～40%的蝦頭、蝦殼等加工副產(chǎn)物,其中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、幾丁質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。目前蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)品主要以廢棄物或者低值飼料的形式處理,造成資源的巨大浪費甚至污染環(huán)境。因此合理地開發(fā)利用這部分資源,對相關(guān)產(chǎn)業(yè)附加值提升,促進增收增效具有重要意義。

鈣是人體必不可少的元素,膳食中鈣營養(yǎng)狀況與人體生長發(fā)育、心血管疾病以及慢性病密切相關(guān),攝入足量的鈣對改善骨質(zhì)疏松癥狀具有重要的作用[4-7]。各類調(diào)查研究顯示,我國居民的鈣攝入量偏低[8-10]。食用補鈣制劑是改善居民鈣營養(yǎng)狀況,預(yù)防骨質(zhì)疏松的重要途徑。

目前鈣劑產(chǎn)品主要分為無機鈣、有機酸鈣、氨基酸鈣、肽鈣等類別[11-12]。其中無機鈣劑的鈣含量高,但溶解性差,生物利用率低;有機酸鈣劑溶解性較好,但鈣含量低,總體吸收較差;氨基酸鈣劑化學(xué)穩(wěn)定性好,能使鈣通過氨基酸載體被人體較完整地吸收,但價格昂貴[13]。肽鈣是由小肽末端氨基及鄰近的肽鏈與鈣形成單環(huán)螯合結(jié)構(gòu),和氨基酸鈣相比,具有吸收速度更快,更穩(wěn)定且不易飽和等優(yōu)點[12],因此肽鈣螯合物近年來已成為補鈣制劑的新研究熱點。目前相關(guān)研究主要是集中在魚鱗[14]、卵黃[15]、蛋清[16]、大豆[17]等原料,而水解蝦殼蛋白制備肽鈣螯合物的研究鮮有報道。

本研究以蝦殼為原料,以水解度和持鈣能力為評價指標(biāo),研究了蛋白酶水解制備促鈣吸收肽的最佳工藝,為蝦殼資源的后續(xù)研究和開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦殼 溫州市錦達味業(yè)食品有限公司;中性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(100 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(15000 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;甲醛、氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇、氯化鈣、鈣羧酸指示劑、乙二胺四乙酸 國藥集團;試驗所用試劑均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠;DF-2集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 常州華奧儀器制造有限公司;UNIVERSAL 320R離心機 德國Hettich科學(xué)儀器有限公司;WF18超微粉碎機 溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司;722型可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦殼粉末制備 蝦殼經(jīng)100 ℃熱風(fēng)干燥去除水分后,用超微粉碎機進行粉碎,蝦殼粉末置于4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氨基酸組成分析 蝦殼的氨基酸組成按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[18]的方法進行預(yù)處理,采用日立L-8800全自動氨基酸分析儀進行氨基酸組成分析。

1.2.3 酶活力測定 實驗用蛋白酶活力測定采用福林酚法[19]。以酪蛋白溶液為底物,在各蛋白酶適宜的條件下每分鐘催化酶解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(U)。酪氨酸濃度(μg/mL)與吸光度的關(guān)系為y=0.0103x+0.0024(R2=0.9993)。

1.2.4 酶解工藝 稱取適量的蝦殼粉,按照物料質(zhì)量加入一定體積的去離子水,置于磁力攪拌器上,調(diào)節(jié)溶液pH后按一定比例加入蛋白酶,在蛋白酶最適溫度下進行酶解反應(yīng)。酶解過程中每隔15 min 用3 mol/L HCl或NaOH維持pH穩(wěn)定。酶解結(jié)束后95 ℃滅酶15 min,冷卻至室溫后調(diào)節(jié)酶解液pH至7.0,4000 r/min離心15 min。取上清液定容后,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 水解度測定 采用中性甲醛電位滴定法[20]測定游離氨基氮含量。樣品總氮含量采用凱氏定氮法[21]測定。

1.2.6 鈣離子結(jié)合活性測定 在乙醇等有機溶劑中,螯合鈣的溶解度較小,而未螯合的多肽和鈣離子可以在溶劑中溶解,因此可以采用乙醇沉淀法將酶解液螯合鈣從溶液中分離出來[22]。鈣離子結(jié)合活性測定按照趙立娜等[16]的方法略加修改,在具塞試管中加入5 mL酶解液、少量5mmol/L的CaCl2和30 mL無水乙醇,充分混勻后在37 ℃溫育30 min。然后4 ℃ 8000 r/min離心15 min,棄去上清液。取沉淀加入去離子水溶解,定容后用EDTA絡(luò)合滴定法檢測沉淀中的鈣含量[23]。

1.2.7 單因素實驗 分別以酶解液的水解度和鈣結(jié)合量為指標(biāo),首先比較堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在各自的適宜條件下對蝦殼蛋白的水解效果,反應(yīng)條件見表1。再按照堿性蛋白酶酶解基礎(chǔ)條件:酶添加量3000 U/g,底物濃度10%,pH10.0,反應(yīng)溫度50 ℃,水解時間4 h,以鈣結(jié)合量和水解度為評價指標(biāo),固定其他變量來分別考察各單因素對水解效果的影響,單因素試驗水平表見表2。

表1 五種酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of five kinds of enzymes

表2 酶解單因素試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of single-factortest for enzymatic hydrolysis

1.2.8 響應(yīng)面試驗 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理,基于單因素試驗結(jié)果,以鈣結(jié)合量為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面實驗確定最佳酶解條件,因素水平表見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計因素水平表Table 3 Factors and levels table of response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦殼氨基酸組成分析

肽的氨基酸組成及結(jié)構(gòu)會在一定程度上影響其結(jié)合鈣離子能力,如酪蛋白磷酸肽[24-26]和卵黃磷酸肽[27-29]中富含的磷酸絲氨酸基團被認(rèn)為與其結(jié)合金屬離子的能力密切相關(guān)。也有研究表明,不含磷酸基團的肽也有鈣結(jié)合能力[14,30],其中的谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸和甘氨酸等在肽與鈣結(jié)合過程中起著重要作用[31-33]。對蝦殼進行氨基酸分析,結(jié)果見表4。

表4 蝦殼氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of shrimp shell

氨基酸組成分析表明,蝦殼中蛋氨酸含量最高,其次為谷氨酸和天門冬氨酸,分別占總量的12.3%、12.0%和9.6%。吳長平等[34]利用鰻魚尾制備鈣螯合肽后發(fā)現(xiàn)反應(yīng)中,谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的貢獻最大。包小蘭[17]的研究也表明,大豆蛋白肽的鈣結(jié)合活性與肽鏈中谷氨酸和天冬氨酸含量呈正相關(guān)。此外,甘氨酸、亮氨酸、精氨酸等含量也較豐富。因此蝦殼蛋白是一種較好的鈣離子結(jié)合活性肽原料。

2.2 蛋白酶的篩選

通過蛋白酶的酶切作用,可以從蛋白質(zhì)中釋放出具有生物活性的肽類,測定蝦殼在各蛋白酶的適宜pH與酶解溫度下(表1)所得酶解液的氨基態(tài)氮含量和鈣離子結(jié)合活性,結(jié)果見圖1。

圖1 不同蛋白酶對水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.1 Effect of different proteases on theDH and calcium-binding amount

由圖1可以看出,在堿性蛋白酶作用下,蝦殼的水解度最高,且酶解液鈣離子結(jié)合能力最強,這主要是由于堿性蛋白酶是一種有著寬廣作用范圍的絲氨酸內(nèi)肽酶,能夠裂解Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gly的羧端肽鍵。胰蛋白酶酶解能力與堿性蛋白酶相當(dāng),但鈣離子的螯合力弱于堿性蛋白酶。綜合考慮酶解液的兩項指標(biāo),選擇堿性蛋白酶作為實驗的酶解用酶。

2.3 單因素試驗

2.3.1 pH對蝦殼粉酶解效果的影響 根據(jù)堿性蛋白酶的最適pH范圍,取pH分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0進行實驗。由圖2可知,在該反應(yīng)體系中,pH大小對產(chǎn)物水解度和鈣結(jié)合能力均有較顯著的影響。這主要是由于堿性蛋白酶有其最適pH,當(dāng)溶液中pH較低時,會影響酶構(gòu)象改變,降低酶活力[35]。由圖2看出,隨反應(yīng)液pH的升高,樣品的水解度和鈣結(jié)合量都逐步提高,至pH為10.0時趨于平緩。因此,綜合考慮選擇酶解的pH范圍為10.0～11.0。

圖2 pH對水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.2 Effect of pH on the DH and calcium binding amount

2.3.2 酶添加量對蝦殼粉酶解效果的影響 由圖3可知,當(dāng)堿性蛋白酶添加量從2500 U/g增加到3500 U/g,樣品水解度明顯提高,在4000 U/g以上時趨于穩(wěn)定,說明此時對底物的酶解效果接近飽和。產(chǎn)物對鈣離子的結(jié)合能力在蛋白酶添加量為4000 U/g時達到峰值,繼續(xù)增大酶用量反而抑制鈣結(jié)合量。這說明雖然酶添加量提高可以使蝦殼蛋白的水解度提高,但同時也會使酶解液中的鈣離子結(jié)合活性肽更易被降解為無鈣結(jié)合能力的游離氨基酸,令其純度降低。結(jié)合兩種指標(biāo),選擇酶添加量為3500～4500 U/g。

圖3 酶添加量對水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on theDH and calcium binding amount

2.3.3 酶解時間對蝦殼粉酶解效果的影響 由圖4可知,反應(yīng)前期,水解度和鈣結(jié)合量均明顯上升,并在水解5 h時達到最高值。這可能是因為隨著水解程度的提高,產(chǎn)物中的多肽含量提高,與鈣結(jié)合的位點變多,使產(chǎn)物的鈣結(jié)合能力變強[36]。但5 h后多肽被分解為氨基酸的速度大于多肽產(chǎn)生的速度,因此兩項指標(biāo)均出現(xiàn)下降。結(jié)合兩種指標(biāo),確定酶解時間范圍為4～6 h。

圖4 酶解時間對水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.4 Effect of time on theDH and calcium binding amount

2.3.4 酶解溫度對蝦殼粉酶解效果的影響 反應(yīng)體系中,溫度的提高會加快物質(zhì)運動速率,特別是底物與酶的接觸幾率,從而促進反應(yīng)。但過高的溫度也會導(dǎo)致蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂,導(dǎo)致酶活性降低,延緩了酶解進程[37]。從圖5中看出,在40～55 ℃的溫度范圍內(nèi),隨溫度升高,酶解液中的水解度逐漸提高,酶解液的鈣離子結(jié)合能力也隨溫度升高而上升。而當(dāng)溫度高于55 ℃,相對高溫會使堿性蛋白酶的活性減弱,影響酶解效率。另外,高溫也可能導(dǎo)致促鈣吸收肽的結(jié)構(gòu)被破壞。雖然產(chǎn)物的水解度變化不大,但鈣離子結(jié)合能力有所減弱。結(jié)合兩種指標(biāo),確定最佳酶解溫度范圍在50～60 ℃。

圖5 酶解溫度對酶解液的水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.5 Effect of temperature on theDH and calcium binding amount

2.3.5 底物濃度對蝦殼粉酶解效果的影響 不同底物濃度對蝦殼蛋白水解度和鈣結(jié)合量的影響見圖6。隨底物濃度從低到高,底物與酶的接觸機會變多,前期樣品水解度和鈣結(jié)合能力不斷提高。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?%,濃度提高反而使水解度降低,且當(dāng)濃度超過10%時急速下降。而鈣結(jié)合能力也隨底物濃度變大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在10%達到峰值?？赡苁怯捎谳^高的底物濃度會導(dǎo)致酶解液過于粘稠,令有效的酶切位點減少,影響目標(biāo)肽的生成[38]。綜合兩個指標(biāo),選擇底物濃度為10%。

圖6 底物濃度對酶解液的水解度和鈣結(jié)合量的影響Fig.6 Effect of substrate concentrationonthe DH and calcium binding capacity

2.4 響應(yīng)面試驗分析

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 在單因素實驗基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗對水解條件進行優(yōu)化,選擇pH(A)、酶添加量(B)、酶解時間(C)、酶解溫度(D)4個因素,以鈣結(jié)合量(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken設(shè)計實驗,根據(jù)Design-Expert設(shè)計試驗方案和結(jié)果見表5。通過回歸擬合后,得到鈣結(jié)合量與4個因素之間的回歸方程:Y=1.91+0.077A+0.11B+0.12C-0.031D

表5 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis for the established native regression model

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。-1×10-2AB-7.5×10-3AC+1×10-2AD+7.5×10-3BC+5×10-3BD+0.032CD-0.11A2-0.24B2-0.16C2-0.095D2。

方差分析結(jié)果與顯著性檢驗結(jié)果見表6。模型的F值為111.06,P值小于0.0001,表明模型極顯著。失擬項的P值大于0.05,表明模型失擬不顯著。其中,A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01,差異極顯著;CD的P值小于0.05,差異顯著。

表7 模型的可信度分析Table 7 The credibility analysis of the model

2.4.2 響應(yīng)面曲面分析 響應(yīng)面圖和等高線圖能直觀地反映出各因素間的相互關(guān)系及相互作用程度。對于雙因素間的交互作用,模型中只有CD(酶解時間-酶解溫度)交互作用顯著(P<0.05)。根據(jù)Design Expert軟件得出的回歸模型各因素相互之間作用如圖7所示。

圖7 酶解時間與酶解溫度間的交互作用分析Fig.7 The interaction of time and temperature

從圖中可以看出,pH和酶添加量一定時,隨著酶解時間和溫度的升高,酶解液的鈣結(jié)合能力先升高后降低,在接近中心點時取得最大值。

2.4.3 最佳工藝參數(shù)確定及驗證試驗 以酶解液的鈣結(jié)合量最大值為指標(biāo),經(jīng)過模型預(yù)測,最佳提取條件為:pH10.16,酶添加量4116 U/g,酶解時間5.374 h,酶解溫度54.617 ℃,預(yù)測的鈣結(jié)合量可達到1.957 mg/mL?？紤]到實際應(yīng)用,調(diào)整驗證工藝參數(shù)為pH10.2,酶添加量4100 U/g,酶解時間5.5 h,酶解溫度55 ℃,在此條件下試驗3次。實際測得的酶解液水解度達到16.33%±0.27%,鈣結(jié)合量平均值為(1.954±0.02) mg/mL,與理論值僅差0.003 mg/mL,說明該模型具有較好的實用價值。

3 結(jié)論

本研究以蝦殼為原料,研究促鈣吸收肽的酶解工藝。通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化,結(jié)合實際生產(chǎn)條件,確定其最佳酶解條件為pH10.2,堿性蛋白酶添加量4100 U/g,酶解時間5.5 h,酶解溫度55 ℃,在此條件下酶解液的水解度可達到16.33%,鈣結(jié)合量達1.954 mg/mL。制備得到的蝦殼多肽具有較強的鈣離子結(jié)合能力,在新型鈣制品開發(fā)的領(lǐng)域具有較好的前景。