張 曄,劉志偉,譚興和

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410000)

蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素,C40H52O4)是一種脂溶性酮式類胡蘿卜素,具有極強(qiáng)的抗氧化作用,其自由基抗氧化活性比維生素E高500倍,比β-胡蘿卜素高38倍[1]。同時(shí),蝦青素還具有抗癌[2]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[3]、抵抗組織損傷[4]和心血管疾病等功能[5]。近年來已被廣泛應(yīng)用于化妝品[6]、醫(yī)藥[7]、保健品[8]及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[9]。蝦青素主要存在于各種微生物以及微藻中,其中雨生紅球藻是天然蝦青素最主要的來源[10-11]。雨生紅球藻是一種單細(xì)胞雙鞭毛微藻,在逆境條件下(強(qiáng)光、高溫、營(yíng)養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、高鹽)經(jīng)過一系列的形態(tài)變化最終形成一種含較高蝦青素含量的成熟紅色、非運(yùn)動(dòng)性囊胞[12]。其蝦青素積累量最高可達(dá)藻細(xì)胞干質(zhì)量的4.0%以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水產(chǎn)品廢棄物(蝦、蟹等甲殼)中和紅發(fā)夫酵母(Phaffiarhodoxyma)(0.15%～0.4%)中蝦青素的含量[13]。但成熟的雨生紅球藻厚而致密的細(xì)胞壁導(dǎo)致有機(jī)溶劑很難直接滲透到細(xì)胞內(nèi)部,影響胞內(nèi)蝦青素提取效率[14],因此雨生紅球藻破壁處理成為蝦青素提取的關(guān)鍵工藝。

目前常用的蝦青素提取方法主要有超聲波輔助和微波輔助提取[15]、有機(jī)溶劑浸提[16]、酶法輔助提取[17]、超臨界流體萃取法[18]以及高壓均質(zhì)法[19]。超聲波和微波輔助提取設(shè)備昂貴、并且Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)采用超聲波輔助和微波輔助提取會(huì)降低蝦青素的生物活性。直接使用有機(jī)溶劑浸提不僅耗費(fèi)時(shí)長(zhǎng),且提取率較低,Sarada等[21]使用了多種有機(jī)溶劑進(jìn)行浸泡提取,其中最好的一種有機(jī)溶劑提取率也只有22%。超臨界流體CO2萃取法成本較高,不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。高壓均質(zhì)法對(duì)均質(zhì)機(jī)設(shè)備要求較高,且在生產(chǎn)中設(shè)備零件損耗較大,常常不能連續(xù)生產(chǎn)。相較于其他幾種方法,酶法具有反應(yīng)條件溫和、設(shè)備操作簡(jiǎn)單、用料少、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是最具潛力的一種提取方法。Kobayashi等[22]使用了纖維素酶和裂解酶處理雨生紅球藻,有效地獲得了蝦青素但并沒有具體探討工藝參數(shù)對(duì)蝦青素提取率的影響。

雨生紅球藻細(xì)胞壁是由纖維素蛋白和果膠物質(zhì)組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),采用纖維素酶和果膠酶能夠水解植物細(xì)胞壁,提高生物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性,加速細(xì)胞內(nèi)溶物質(zhì)流出功能[23-24]。溶菌酶同樣能夠有效地降解細(xì)胞壁的成分,有助于細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放[25-26]。因此,本文采用了纖維素酶、果膠酶和溶菌酶三種單酶以及四種不同比例的復(fù)合酶輔助破壁提取雨生紅球藻蝦青素。通過響應(yīng)面法對(duì)酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,旨在為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雨生紅球藻粉 云南省白鷗生物技術(shù)有限公司,純度:3.5%;纖維素酶(酶活力:400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;果膠酶(酶活力:500 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;溶菌酶(酶活力:20000 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;乙酸、乙酸鈉、甲醇均(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

H-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理化學(xué)光學(xué)儀器廠;TGW16臺(tái)式高速微量離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;WFJ-7200型可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;AL-204電子天平(精確至0.0001 g) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 雨生紅球藻粉末冷凍干燥后用鋁箔紙密封儲(chǔ)存于-18 ℃中備用。

1.2.2 酶法提取雨生紅球藻中蝦青素工藝 參考Liu等[27]的方法,固定料液比為10∶1 (mg/mL)準(zhǔn)確稱取10 mg雨生紅球藻粉末置于10 mL連蓋離心管中,加入1 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,調(diào)節(jié)pH,分別加入一定量的纖維素酶、果膠酶、溶菌酶以及復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=1∶1 (U/U);纖維素酶∶果膠酶=2∶1 (U/U);纖維素酶∶果膠酶=1∶2 (U/U)纖維素酶∶果膠酶∶溶菌酶=1∶1∶1 (U/U/U)),在預(yù)定條件下進(jìn)行酶解反應(yīng),滅酶后用9000 r/min的離心機(jī)離心10 min,取離心沉淀物加入4 mL甲醇在50 ℃水浴鍋中提取1 h,收集上清液再加4 mL甲醇于50 ℃水浴鍋中提取1 h,合并兩次上清液,備用。

1.2.3 酶法提取雨生紅球藻中蝦青素單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶的種類和酶含量大小對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 酶法提取過程中,影響提取率最重要的因素是酶的種類和酶含量大小。為了探究這些因素對(duì)蝦青素提取率的影響規(guī)律,對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了設(shè)置:在大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上控制酶解溫度為50 ℃,酶解pH為5.0,酶解時(shí)間為6 h,比較單一酶(纖維素酶、果膠酶、溶菌酶)、復(fù)合酶(纖維素∶果膠酶=1∶1,U/U;纖維素∶果膠酶=2∶1,U/U;纖維素酶∶果膠酶=1∶2,U/U;纖維素酶∶果膠酶∶溶菌酶=1∶1∶1,U/U)在加酶量為5000、6000、7000、8000、9000、10000 U/mL時(shí)對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取率的影響,每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解溫度50 ℃、pH5.0,加酶量為7000 U/mL,分別測(cè)定酶解時(shí)間為4、5、6、7、8 h對(duì)雨生紅球藻蝦青素的提取率的影響。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.3 酶解溫度對(duì)雨生紅球藻蝦青素的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解pH5.0、酶解時(shí)間6 h,加酶量為7000 U/mL,分別測(cè)定了酶解溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.4 酶解pH對(duì)雨生紅球藻蝦青素的影響 選取提取率最高的一組酶,固定酶解時(shí)間6 h、酶解溫度50 ℃,加酶量為7000 U/mL,分別測(cè)定了酶解pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.健全完善巡視工作制度體系。認(rèn)真梳理已經(jīng)建立的規(guī)章制度，學(xué)習(xí)借鑒上級(jí)出臺(tái)的制度規(guī)范，針對(duì)企業(yè)巡視工作的現(xiàn)實(shí)和長(zhǎng)遠(yuǎn)需要，制定完善配套制度，形成與企業(yè)巡視工作發(fā)展相適應(yīng)的系統(tǒng)規(guī)范、配套完善的制度體系。研究制定巡視工作領(lǐng)導(dǎo)小組、辦公室和巡視組工作規(guī)范，巡視工作有關(guān)事項(xiàng)移交督辦辦法，巡視發(fā)現(xiàn)重大問題線索的處理辦法，巡視工作成果運(yùn)用協(xié)調(diào)機(jī)制等規(guī)章制度，使巡視工作的制度體系在巡視實(shí)踐中得到不斷豐富和完善。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇纖維素與果膠酶酶活力配比為(1∶1,U/U),加酶量為7000 U/mL,以酶解溫度、酶解時(shí)間和pH作自變量,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),以蝦青素提取率為指標(biāo),確定復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of theoptimization paramters used in response surface analysis

1.3 蝦青素含量的測(cè)定。

采用美國(guó)Cyanotech公司[28]的方法測(cè)定蝦青素的含量。得到的上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)于476 nm處測(cè)定吸光值,甲醇用于空白測(cè)定。提取率表示提取得到的蝦青素占雨生紅球藻中蝦青素總量的比例。按下列公式進(jìn)行計(jì)算。

X(mg)=C×8×15

式中：C:類胡蘿卜素的含量;A:476 nm處的吸光值;250:消光系數(shù)。

X:類胡蘿卜素的質(zhì)量;8:甲醇的體積;15:稀釋倍數(shù)。

Y:雨生紅球藻中蝦青素的提取率;M:樣品的質(zhì)量(mg);80%:類胡蘿卜素中蝦青素的含量;3.5%:藻粉中蝦青素的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 8.0和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶的種類和加酶量對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 結(jié)果如圖1所示,不同種類的酶對(duì)雨生紅球藻蝦青素的提取率均隨著酶添加量的增加呈現(xiàn)先增大后緩慢下降的變化趨勢(shì)。造成這種現(xiàn)象的原因主要是因?yàn)槊附獾孜镉邢?當(dāng)酶解反應(yīng)達(dá)到飽和時(shí),繼續(xù)增大加酶量會(huì)引起酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,導(dǎo)致提取率的降低[29]。

圖1 酶種類和酶活力大小對(duì)雨生紅球藻中蝦青素提取率的影響Fig.1 Effects of type and activity of enzymeon the yield of astaxanthin from H. pluvialis注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖2所示,當(dāng)酶解時(shí)間小于6 h時(shí),蝦青素提取率間具有顯著差異(P<0.05),蝦青素的提取率隨著酶解時(shí)間的增加而增大,由53.64%升高到了70.19%;并且在6 h時(shí),蝦青素的提取率達(dá)到最大,為70.19%,酶解反應(yīng)在4～6 h內(nèi),復(fù)合酶的活性逐漸達(dá)到最大,能夠充分地與紅球藻細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)反應(yīng),增強(qiáng)了酶的滲透效果,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的流出。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間提取率反而有所下降,由70.19%下降到66.85%。出現(xiàn)這種變化趨勢(shì)的原因主要是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間范圍內(nèi),隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶解反應(yīng)逐漸反應(yīng)徹底,超出一定時(shí)間范圍后,繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間反而會(huì)抑制酶活性的發(fā)揮。此外,從雨生紅球藻中釋放出的蝦青素不穩(wěn)定,長(zhǎng)時(shí)間暴露于外部環(huán)境中可能發(fā)生氧化降解反應(yīng),因此延長(zhǎng)提取時(shí)間內(nèi)觀察到蝦青素提取率降低可能反應(yīng)了由于氧化導(dǎo)致蝦青素的損失[31-32],所以選擇最佳酶解時(shí)間為6 h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on theyield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.3 酶解溫度對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖3所示,不同的酶解溫度對(duì)蝦青素的提取率均具有顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)溫度低于50 ℃時(shí),隨著溫度的升高,蝦青素的提取率也隨之升高,從48.76%升高到了70.08%,并且在50 ℃提取率達(dá)到最大;當(dāng)溫度超過50 ℃時(shí),蝦青素提取率急劇下降,從70.08%下降到了40.70%。造成該趨勢(shì)的主要原因是因?yàn)樵谝欢囟确秶鷥?nèi),酶的活性會(huì)隨著溫度的升高逐漸升高,當(dāng)達(dá)到酶的最大活性時(shí),繼續(xù)升高溫度酶受熱發(fā)生變性,導(dǎo)致酶活力的降低甚至失活,從而減緩的蝦青素的提取率。這一結(jié)果與Zuorro等[33]使用酶法提取微藻中油脂的報(bào)道一致。并且溫度過高對(duì)蝦青素的結(jié)構(gòu)也會(huì)造成一定的破壞。因此選擇最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.3 Eeffect of hydrolysis temperatureon the yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.1.4 酶解pH對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響 如圖4所示,當(dāng)pH低于5.0時(shí),蝦青素提取率隨著pH的升高逐漸升高且具有顯著性差異(P<0.05),由48.41%升高到了70.11%,并且在pH為5.0時(shí)達(dá)到最大;當(dāng)pH超過5.0時(shí),蝦青素的提取率顯著下降(P<0.05),由70.11%下降到了48.96%。說明pH過大過小都會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)造成較大的影響,只有在最適的pH范圍內(nèi),酶與底物才會(huì)充分結(jié)合,酶解反應(yīng)速度達(dá)到最大。因此,當(dāng)纖維素-果膠酶復(fù)合酶的pH在5.0左右時(shí),其酶活性最好,對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞壁的降解和破壞達(dá)到最大。李亞輝等[34]使用纖維素酶和果膠酶復(fù)合提取蘆薈多糖也是在酸性范圍內(nèi)獲得最佳pH。所以選擇最佳酶解pH為5.0。

圖4 pH對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率的影響Fig.4 Effect of pH values on theyield of astaxanthin from H. pluvialis

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 響應(yīng)面設(shè)計(jì):固定加酶量為7000 U/mL,復(fù)合酶中纖維素酶和果膠酶酶活力配比為1∶1 (U∶U),以酶解時(shí)間(A)、酶解溫度(B)和酶解pH(C)為自變量,以雨生紅球藻蝦青素提取率為響應(yīng)值,結(jié)果見表2。用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表三數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到雨生紅球藻蝦青素提取率對(duì)上述3個(gè)自變量的二次回歸方程:Y=69.95-1.44A-3.32B-1.15C-4.34AB+2.22AC-3.00BC-4.58A2-15.12B2-6.67C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

2.2.2 回歸模型方差分析 對(duì)回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表3),結(jié)果表明該試驗(yàn)選用的模型極顯著(P<0.0001),方差失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3820>0.05),說明模型的選擇是合理的;此外,回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.9883,表明二次回歸方程與試驗(yàn)結(jié)果的擬合度良好,可以用于復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的分析與預(yù)測(cè)。同時(shí),從表3結(jié)果還可以得出酶解溫度(B)、酶解pH和酶解溫度交互項(xiàng)(AB)、酶解溫度和酶解時(shí)間交互項(xiàng)(BC)、酶解pH二次項(xiàng)(A2)、酶解溫度二次項(xiàng)(B2)、酶解時(shí)間二次項(xiàng)(C2)極顯著(P<0.01),酶解pH(A)、酶解pH和酶解時(shí)間交互項(xiàng)(AC)均顯著(P<0.05),說明這幾個(gè)因素對(duì)蝦青素提取率影響較大,根據(jù)F值大小,可知影響因素的主次順序?yàn)?A(酶解溫度)>B(酶解pH)>C(酶解時(shí)間)。

表3 二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance the regression model

2.2.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定 為了進(jìn)一步分析酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH對(duì)響應(yīng)面值的影響,固定其中的1個(gè)因素,使其處于中心水平,繪制其他兩個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面,對(duì)兩因素的相互作用進(jìn)行分析。圖5所示的3組響應(yīng)面及等高線的形狀可以分析出隨著各因素水平的升高或延長(zhǎng),蝦青素的提取率均呈現(xiàn)先增大后減少的變化特征。并且,響應(yīng)面的陡峭程度和等高線的形狀可以反應(yīng)兩因素之間的作用顯著程度。其中,響應(yīng)面越陡,等高線的形狀越偏向橢圓表明兩因素之間的交互作用越顯著。由圖c可以清楚的看出酶解溫度和酶解pH之間的交互作用最顯著,且等高線沿酶解溫度軸變化更加密集,而沿pH軸變化相對(duì)稀疏,最后結(jié)合響應(yīng)面的陡峭程度得出酶解溫度對(duì)蝦青素提取率的影響要大于酶解pH。同理,由圖a、b可以得出酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響要低于酶解溫度和酶解pH,這與表3方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)雨生紅球藻蝦青素提取率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showingthe effects of interactions among different factorson the extraction yield of astaxanthin from H.pluvialis

2.2.4 提取工藝的優(yōu)化與驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.0分析優(yōu)化,得出酶法提取雨生紅球藻中的蝦青素的最佳工藝條件為酶解時(shí)間5.91 h、酶解pH4.93、酶解溫度49.19 ℃,在此條件下,蝦青素的提取率預(yù)測(cè)值為70.21%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的可行性,采取優(yōu)化后的條件進(jìn)行酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。考慮到操作的可行性,將酶解時(shí)間設(shè)為6 h、酶解pH4.9,酶解溫度為49 ℃,在此條件下進(jìn)行了5次重復(fù)試驗(yàn)。經(jīng)上述優(yōu)化后的條件提取后,雨生紅球藻中蝦青素的平均提取率為71.08%,與預(yù)測(cè)值相比,相對(duì)誤差為1.2%,因此響應(yīng)面優(yōu)化后的條件是可行的,具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)復(fù)合酶提取雨生紅球藻蝦青素的條件進(jìn)行了優(yōu)化,并建立了可靠的二次多項(xiàng)模型。通過方差分析表明,模型的擬合度較好。在纖維素酶和果膠酶酶活力配比1∶1 (U/U),加酶量7000 U/mL條件下,優(yōu)化最優(yōu)組合為:酶解時(shí)間6 h、酶解pH4.9、酶解溫度為49 ℃。在此條件下重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)得到的平均提取率為71.08%±0.26%,與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.2%,具有良好的擬合度。其中采用混合有機(jī)溶劑直接浸提法[35]和變頻微波輔助提取法[36],得到的蝦青素提取率分別為36.21%和36.88%,相比之下采用復(fù)合酶法能夠使蝦青素的提取率得到大幅度的提升?？蔀楣I(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值。