董晶劍，沈斌，肖艷萍，曹青日，施麗麗,

(1嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314001；2蘇州大學(xué)藥學(xué)院)

艾塞那肽是第一個(gè)人工合成的腸降血糖素類似物，由39個(gè)氨基酸組成[1]。艾塞那肽能促使葡萄糖依賴的胰島素分泌，延緩胃排空，改善胰腺β細(xì)胞功能[2,3]，治療2型糖尿病療效顯著，展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景[4]。作為多肽類藥物，艾塞那肽體內(nèi)穩(wěn)定性差，半衰期短，口服生物利用度低，目前臨床采用皮下注射給藥，然而頻繁注射造成患者順應(yīng)性差，且皮下注射難以達(dá)到持續(xù)激活胰高血糖素1(GLP-1)受體的作用[5]，療效不持久。因此，研發(fā)長效口服制劑意義重大。由于口服吸收過程存在層層屏障，將艾塞那肽制成普通口服制劑缺乏可行性。將多肽類藥物包裹于納米給藥系統(tǒng)內(nèi)，可增強(qiáng)其在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對(duì)多肽類藥物的攝取，從而提高口服生物利用度[6,7]。固體脂質(zhì)納米粒(SLNs)作為常用的納米給藥系統(tǒng)，具有生物相容性好、保護(hù)藥物免受胃腸道酶降解、促進(jìn)藥物口服吸收等優(yōu)勢(shì)，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。已有研究表明，固體納米?？擅黠@增強(qiáng)胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性，提高其口服生物利用度[9,10]。2017年10月～2019年4月，本研究將艾塞那肽包裹于SLNs，以羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HACC)進(jìn)行修飾，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY96-11N型，寧波新芝生物科技公司)，高分辨透射電鏡(TecnaiG220型，美國FEI公司)，激光粒度分析儀(HPP5001型，英國馬爾文公司)，超速離心機(jī)(OPTIMAL-90K型，美國BECKMAN公司)，跨膜電阻測(cè)定儀(Millicell-ERS型，美國密理博公司)。艾塞那肽[批號(hào)P141017-3-LP052143，吉爾生化(上海)有限公司]，單硬脂酸甘油酯(化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，大豆磷脂(S100，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司)，二氯甲烷(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，HACC(南通綠神生物工程有限公司)，聚乙烯醇(Sigma公司)。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2及人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞株Raji B購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 納米粒制備 采用復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒。內(nèi)水相：將30 mg艾塞那肽溶于1 mL水中。油相：20 mg大豆磷脂S-100溶于加有2 mL二氯甲烷的西林瓶內(nèi)，70 ℃水浴下將60 mg單硬脂酸甘油酯盛于西林瓶內(nèi)，將上述兩個(gè)西林瓶內(nèi)油相混合得到均一油相。將水相快速加至油相，200 W超聲60 s得到初乳，將初乳迅速轉(zhuǎn)移到20 mL外水相(1% PVA)中，攪拌得復(fù)乳，室溫持續(xù)攪拌5 h去除有機(jī)溶劑，得到納米?；鞈乙?Exenatide-SLNs)。在納米?；鞈乙褐芯徛渭?.1% HACC水溶液，使Exenatide-SLNs混懸液與0.1% HACC修飾液體積比為1∶4[11,12]，200 W超聲90 s，室溫?cái)嚢? h，得到HACC修飾的艾塞那肽SLNs(HACC-Exenatide-SLNs)。

1.3 納米粒理化性質(zhì)及載藥量檢測(cè) 取納米粒懸液，滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上，于紅外燈下烘干，采用高分辨透射電鏡觀察其形態(tài)。取適量納米粒懸液，以蒸餾水進(jìn)行稀釋，激光粒度儀測(cè)其粒徑及表面電位。取0.1 mL納米粒懸液于2 mL EP管內(nèi)，加入適量甲醇破乳，高速離心取上清，以HPLC法測(cè)定上清液中的艾塞那肽，即為W總。取0.1 mL納米粒懸液，外水相稀釋10倍后超速離心45 000 r/min、45 min。以HPLC法測(cè)定上清液中游離的艾塞那肽，即為W游離。按公式[13]計(jì)算載藥量。載藥量=(W總-W游離)/W載體×100 %。其中，W總為艾塞那肽總量，W游離為未載入納米粒的艾塞那肽，W載體為載體質(zhì)量。

1.4 黏膜濾泡相關(guān)上皮(FAE)單層細(xì)胞模型建立 按文獻(xiàn)方法培養(yǎng)Caco-2、Raji B細(xì)胞并建立FAE模型[14]。FAE模型具體制作過程：Caco-2單層細(xì)胞培養(yǎng)13 d后，按1×106/mL在Millipore跨膜小室的BL側(cè)(基底側(cè))加入Raji B細(xì)胞，AP側(cè)(腸腔側(cè))每日更換培養(yǎng)基，BL側(cè)每日半量更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第19天，測(cè)定跨膜電阻值(TEER)[15]并檢測(cè)M細(xì)胞特異表達(dá)的UEA-1蛋白[16]。Caco-2單層細(xì)胞TEER>500 Ω/cm2，加入Raji B細(xì)胞后TEER約為Caco-2單層的60%，單層細(xì)胞表達(dá)UEA-1蛋白，表明已分化出M細(xì)胞，F(xiàn)AE模型建立成功。

1.5 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率測(cè)算 PBS輕輕洗滌符合轉(zhuǎn)運(yùn)條件的FAE模型，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡0.5 h，吸走PBS；在供給池分別加入0.5 mL的艾塞那肽溶液(艾塞那肽溶液組)、Exenatide-SLNs混懸液(Exenatide-SLNs組)、HACC-Exenatide-SLNs混懸液(HACC-Exenatide-SLNs組)；在接收池中加入1.5 mL的HBSS溶液，孵育4 h；從供給池取0.1 mL樣品，接收池取0.2 mL樣品，進(jìn)行液相分析。按照文獻(xiàn)方法計(jì)算藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率[17]。

1.6 緊密連接蛋白Claudin-1檢測(cè) 上述“1.5”藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，去除轉(zhuǎn)運(yùn)液，F(xiàn)AE單層細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入適量裂解液，冰上裂解，12 000 r/min、4 ℃條件離心30 min，取上清，BCA法蛋白定量，用PBS調(diào)整各樣品濃度，沸水浴進(jìn)行蛋白變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(80 V、1 h，120 V、2 h)，電泳結(jié)束后將進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(300 mA，1.5 h)，封閉1 h(5%脫脂奶粉)，TBST洗滌。加入多克隆兔抗Claudin-1于4 ℃過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔IgG，室溫下孵育1 h，TBST洗滌，掃描成像。以GAPDH為內(nèi)參，未進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的FAE細(xì)胞單層作為空白對(duì)照(Control)。使用Image J分析蛋白條帶灰度值，表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 納米粒形態(tài)及理化性質(zhì) 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Exenatide-SLNs形態(tài)近圓形(圖1A)；HACC-Exenatide-SLNs表面變粗糙，有殼聚糖鏈纏繞(圖1B)。HACC-Exenatide-SLNs組粒徑低于Exenatide-SLNs組，表面電位由負(fù)電位變?yōu)檎娢唬d藥量略低于Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。見表1。

圖1 Exenatide-SLNs、HACC-Exenatide-SLNs電鏡下觀察形態(tài)

納米粒粒徑(nm)表面電位(mV)載藥量(%)Exenatide-SLNs226.3±19.8-24.2±2.53.1±0.2HACC-Exenatide-SLNs330.0±16.720.2±1.92.5±0.2

2.2 各組藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率分別為0.27%±0.07%、1.35%±0.11%、2.05%±0.08%，Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率高于艾塞那肽溶液組，且HACC-Exenatide-SLNs組高于Exenatide-SLNs組(P均<0.01)。

2.3 各組細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)比較 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組細(xì)胞中Claudin-1相對(duì)表達(dá)量分別為1.100 5±0.088 2、1.001 7±0.153 8、0.628 4±0.043 9，HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對(duì)表達(dá)量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。

3 討論

艾塞那肽是一種蛋白多肽類藥物，具有很好的治療2型糖尿病的前景。如何選擇合適、高效的給藥途徑是蛋白多肽類藥物開發(fā)過程中至關(guān)重要的問題。目前蛋白多肽的給藥方式主要是注射給藥，然而頻繁注射給患者帶來諸多不便及痛苦。將蛋白多肽類藥物制成口服制劑，可避免注射給藥的痛苦。但蛋白多肽類藥物分子量大，脂溶性低，物理穩(wěn)定性差，難以透過腸道細(xì)胞膜，且易被胃腸道內(nèi)酸和消化酶分解，吸收后易受肝臟首過效應(yīng)，因而將蛋白多肽藥物制備成普通口服制劑無法發(fā)揮療效。SLNs具有穩(wěn)定性高、適用于多種給藥途徑、具有淋巴吸收可避開首過效應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，將蛋白多肽類藥物制備成口服SLNs具有廣闊的開發(fā)前景。

本研究制備了艾塞那肽SLNs，并用HACC對(duì)其進(jìn)行表面修飾。HACC能溶于任意pH值水溶液[18]，由于小分子季銨鹽的存在，HACC具有較強(qiáng)的質(zhì)子化能力、黏膜黏附性能及打開緊密連接的能力。本課題組前期實(shí)驗(yàn)從SLNs混懸液與HACC修飾液的比例、超聲時(shí)間及修飾后攪拌時(shí)間三個(gè)方面優(yōu)化了HACC修飾工藝。體積比對(duì)粒徑有一定影響；超聲可降低粒徑，可能與超聲促使殼聚糖鏈相互纏繞而緊密包裹于SLNs周圍相關(guān)；攪拌過程對(duì)經(jīng)HACC修飾的SLNs粒徑有微小的影響，殼聚糖長鏈的纏繞及解聚是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程。

FAE是體外模擬小腸的一種細(xì)胞模型，是將Caco-2細(xì)胞與Raji B細(xì)胞共孵育，繼而分化出M細(xì)胞所得。與Caco-2細(xì)胞模型相比，F(xiàn)AE模型中M細(xì)胞頂端缺乏黏液層，有利于外源物質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。Shi等[13]將低生物膜透過性藥物扎那米韋包裹于以單硬脂酸甘油酯為類脂質(zhì)的SLNs中，旨在提高其口服生物利用度，但研究結(jié)果表明該納米粒較難通過Caco-2單層膜，認(rèn)為Caco-2單層膜模擬小腸具有一定局限性。因此,有必要使用FAE模型研究納米給藥系統(tǒng)的吸收作用。本研究采用FAE模型對(duì)艾塞那肽納米粒轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，將艾塞那肽制備成SLNs可明顯促進(jìn)其跨FAE單層的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，SLNs表面吸附HACC，藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)量進(jìn)一步增加。分析其原因，HACC具有黏膜黏附性能，可延長藥物與細(xì)胞的接觸時(shí)間，促進(jìn)藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)HACC具有打開細(xì)胞緊密連接的功能，因此能從細(xì)胞旁路途經(jīng)促進(jìn)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。緊密連接是由一系列蛋白組成的復(fù)合物，緊密連接的打開有助于促進(jìn)藥物從旁路途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)[19,20]。本研究結(jié)果顯示，HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對(duì)表達(dá)量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組，表明HACC修飾的納米?？纱龠M(jìn)細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運(yùn)。

SLNs可增加藥物跨膜能力，這對(duì)艾塞那肽口服制劑的開發(fā)具有重要價(jià)值。然而，本研究僅從體外對(duì)納米粒的性質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行觀察，缺乏對(duì)其體內(nèi)應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)，后續(xù)將通過動(dòng)物模型評(píng)價(jià)艾塞那肽SLNs的體內(nèi)降糖效果，為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。