祝合燕

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

在日常使用的藥品中經(jīng)常會遇到某些藥品名稱中含有“復(fù)方”二字，這類“復(fù)方類藥物”顧名思義是由幾種不同類別的藥物組成的復(fù)方制劑，而其命名多為藥品中的主要成分。如復(fù)方甘草酸苷片中含甘草酸苷、甘草酸單銨鹽、甘氨酸、蛋氨酸四種成分，四者均有保肝的治療作用，但以甘草酸苷為主，故而得名。與單方藥物相比，將藥物制成復(fù)方制劑可增加藥物療效，如復(fù)方磺胺甲噁唑由磺胺甲噁唑和甲氧芐啶組成，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用，增強(qiáng)了抗菌活性。某些藥物制成復(fù)方制劑則是為了減少不良反應(yīng)，如卡左雙多巴控釋片，其中的卡比多巴可減少多巴胺在外周組織的生成，從而減少心動過速、心律不齊等外周不良反應(yīng)。此外，某些藥物制成復(fù)方制劑則是為了減少患者服藥次數(shù)，增加患者依從性，如纈沙坦氨氯地平片等藥物。

1 前期調(diào)研

開發(fā)一個復(fù)方類藥物的有關(guān)物質(zhì)分析方法，首先要分析該制劑的處方組成及原研制劑的處方組成、使用說明書、包材及貯藏條件等。了解輔料與原料藥的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)式。查閱文獻(xiàn)和國內(nèi)外藥典尤其是最新修改的EP或USP標(biāo)準(zhǔn)，對有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)做足工作準(zhǔn)備；其次是原料藥的工藝信息，了解合成原料藥的工藝路線和相應(yīng)的起始物料及中間體，對雜質(zhì)研究提供依據(jù)。那些是工藝雜質(zhì)，那些是降解雜質(zhì)做到分類清晰。為后續(xù)的專屬性試驗提供降解途徑[1]。再者對原研品的雜質(zhì)進(jìn)行細(xì)致的剖析，在復(fù)方制劑中對于工藝雜質(zhì)不必太過重視，由于原研品與仿制制劑存在工藝存在差異性。重點了解原研品的降解雜質(zhì)，尤其是降解雜質(zhì)的限度將對仿制制劑的降解雜質(zhì)限度的制定具有指導(dǎo)意義，最后是針對仿制制劑的劑型特點選擇合適的處理方式，摸索能夠最大程度的體現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)的真實情況的樣品處理方式。

2 篩選色譜柱

在色譜柱篩選階段，本著簡單有效的原則，首先選用相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的液相條件進(jìn)行色譜柱的篩選，若是復(fù)方制劑無相關(guān)參考標(biāo)準(zhǔn)，首先選用水和乙腈作為流動相，進(jìn)行色譜柱的篩選，若是化合物對此體系不適用，那么就需要選擇一個合適流動相，加入緩沖鹽或者調(diào)整pH。最好走個全梯度，目標(biāo)是保留時間位于整個色譜方法的時間的三分之一左右，即在此色譜柱上有保留；第二個目標(biāo)是峰形良好，拖尾因子在合適的范圍（0.95-1.05）之內(nèi)，峰高且銳，峰寬在合適的范圍（1min以內(nèi)）之內(nèi)，峰的理論塔板數(shù)達(dá)到2000以上，雜質(zhì)能夠被全部洗脫。

色譜柱類型的選擇要根據(jù)化合物的性質(zhì)進(jìn)行選擇，反向色譜柱的類型主要有C4，C8，C18，苯基柱，氰基柱，氨基柱，針對不同種類的化合物選擇不同色譜柱的類型。由于苯環(huán)的Π電子作用，苯基柱對芳香族的化合物有很強(qiáng)保留，所以針對芳香族化合物物在其他類型色譜柱上沒有保留的情況，可以首選苯基柱。C4，C8的色譜柱可以對極性小的化合物降低保留性，在短的時間內(nèi)洗脫出來。氰基柱和氨基柱正反兩相均可以用，主要分離一些極性強(qiáng)的化合物[2]。

C18色譜柱即十八烷基硅膠鍵合色譜柱（ODS），應(yīng)用范圍用于分離非極性，中等極性，弱極性的化合物。若是對化合物理化性質(zhì)不了解，可以用C18的色譜柱進(jìn)行摸索條件。由于C18色譜柱，在硅膠質(zhì)量和鍵合工藝的不同，會導(dǎo)致對化合物的分離有所區(qū)別，所以在選擇色譜柱時，應(yīng)根據(jù)所分離化合物的性質(zhì)（例如極性，酸堿性）進(jìn)行選擇。

硅膠質(zhì)量分為普通硅膠和高純硅膠兩類，普通硅膠由于帶有負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面金屬含量高，所以會導(dǎo)致堿性化合物的拖尾；高純硅膠金屬含量低，硅羥基的Pka高，堿性化合物不容易拖尾。

鍵合工藝的不同對分離不同性質(zhì)化合物有著很重要的影響，如同樣為ZORBAX系列的色譜柱，SDB-AQ系列可以耐100%水，而Eclipse則不能，原因是SDB-AQ鍵合工藝是二異丙基鍵合固定相，有著很大的空間位阻，可以防止鍵合固定相水解，因此pH可以低于2以下使用且可以耐收較高柱溫，適用高極性化合物的分離。

鍵合工藝中，封端也起到了必不可少的作用，硅膠表面的硅羥基很多，除去鍵合固定相以外，很多剩余的硅羥基裸露在表面，很容易和堿性化合物發(fā)生作用，表現(xiàn)在色譜峰上就是拖尾嚴(yán)重，而ZORBAX Eclipse系列的色譜柱采用雙封端技術(shù)，有效的減少了殘留的硅羥基，適用于堿性化合物的分離，尤其是酸堿混合物的分離。

此外對于某些強(qiáng)極性的HILIC色譜柱也是不錯的選擇。

3 確定波長

復(fù)方制劑波長的確定應(yīng)首先對各雜質(zhì)及主藥進(jìn)行全波長掃描確定各成分的最大吸收波長，依據(jù)盡可能兼顧所有雜質(zhì)最大吸收的原則，盡量選擇比較平坦的波長。防止因波長改變雜質(zhì)含量測定差異變大。對于兼顧不到的雜質(zhì)，校正因子應(yīng)在0.2-5.0之間；若是超過范圍，用外標(biāo)法計算雜質(zhì)含量；此外波長的選擇應(yīng)統(tǒng)一考慮靈敏度和緩沖鹽的截止波長，避免基線的噪音影響檢測能力[3]。

4 確定流動相體系

色譜柱及波長確定后，對流動相進(jìn)行篩選，可以用包含復(fù)方制劑所有雜質(zhì)的混合溶液及破壞試驗中產(chǎn)生雜質(zhì)最多的樣品進(jìn)行摸索，目標(biāo)為所有的雜質(zhì)在該色譜柱和流動相體系下有合適的保留、峰形和分離度。

4.1 梯度條件的選擇

梯度優(yōu)化主要是通過調(diào)節(jié)流動相的起始比例和梯度的斜率來調(diào)整樣品的保留時間、優(yōu)化樣品的分離度。梯度中有機(jī)相起始比例的變化可能對有關(guān)物質(zhì)的分離有影響。在復(fù)方制劑方法開發(fā)中要考慮多個主藥成分的雜質(zhì)分離情況，在有些試驗中有機(jī)相起始比例越小，樣品保留時間越長，隨著梯度的改變，樣品出峰的先后順序也有可能改變。我們做梯度優(yōu)化時主要調(diào)整梯度的起始比例和斜率?，F(xiàn)在的色譜柱或者采用了新的封端工藝，或者內(nèi)嵌極性基團(tuán)，耐水的能力都比較高。在酸性條件下很多化合物都以離子形式存在，極性較大，為了提高樣品的分離度，盡量使用大比例的水做梯度的起始。對于添加緩沖鹽的流動相要注意梯度變化過程中流動相組成改變時是否有鹽析出。對于水加0.1%磷酸的流動相，開始時可以采用95%的水做起始比例，然后以95%的有機(jī)相結(jié)束，注意根據(jù)實際情況在梯度最后用大比例的有機(jī)相沖洗幾分鐘，以保證把小極性的雜質(zhì)洗脫下來，防止樣品殘留到下一針。另外梯度的斜率一般采用凹線型的先小后大，梯度變化先慢后快，在此基礎(chǔ)上再對梯度進(jìn)行優(yōu)化。使用緩沖鹽溶液的梯度水相起始比例一般要從10-20%開始，為了防止鹽析出，在梯度最后避免用純的有機(jī)相做沖洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基礎(chǔ)上根據(jù)方法運行的情況對梯度進(jìn)行調(diào)整。一般一個有關(guān)物質(zhì)的樣品采集的時間控制在40-50分鐘左右，樣品出峰在15-20分鐘左右比較好，如果有極性非常小的雜質(zhì)存在可以在最后加一段時間的大比例有機(jī)溶劑沖洗色譜柱，最后再設(shè)置10到15分鐘左右的重新平衡時間以保證下一針的起始基線不受影響。具體平衡時間要根據(jù)試驗結(jié)果進(jìn)行確定。

4.2 水相pH的選擇，選擇水相的pH應(yīng)根據(jù)化合物的PKa

優(yōu)化峰間距和分離度時，希望樣品保留時間隨pH發(fā)生變化。這時選擇pH在PKa±1范圍內(nèi)改變。其它情況，對于pH的微小變化，我們可能需要保持不變化的分離效果；這就要求pH小于PKa-2或者大于PKa+2，目的為了讓化合物以一種狀態(tài)存在，離子或者分子，避免色譜峰流出時分叉。

4.3 緩沖鹽體系和非緩沖鹽體系的確定

容易離子化的樣品，需要加入緩沖鹽來調(diào)節(jié)其分子和離子狀態(tài)的比例，避免流動相流經(jīng)色譜柱時，一部分隨著流動相先流出，另一部分親和于流動相后流出，導(dǎo)致色譜峰分叉。緩沖鹽濃度：一般為10mmol/L，若是濃度過大會導(dǎo)致在梯度變化中有鹽析出，對儀器有損壞。緩沖鹽的濃度需要根據(jù)樣品的溶解性及對有關(guān)物質(zhì)分離度的影響進(jìn)行確定。此外需要考慮到緩沖鹽的截止波長，所采用波長越接近于緩沖鹽的截止波長，那么基線噪音會越大，在有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)中，影響藥物檢測的靈敏度。

5 確定供試品濃度

根據(jù)復(fù)方制劑中各雜質(zhì)及主成分定量限的濃度，確定供試品的濃度。供試品的濃度一般為定量限濃度的2000至5000倍。保證0.1%水平濃度的樣品的信噪比需要達(dá)到定量限的信噪比。專屬性考察：在保證靈敏度合格的前提下，考察該濃度條件下，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度，專屬性試驗重點對各雜質(zhì)進(jìn)行歸屬，需要對空白輔料、單方的制劑與復(fù)方的制劑進(jìn)行等條件破壞，以明確破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)屬于哪個主成分的降解雜質(zhì)。此時可以采用破壞產(chǎn)生雜質(zhì)最多的供試品調(diào)節(jié)進(jìn)樣量來進(jìn)一步驗證靈敏度是否達(dá)到要求。

綜上所述，通過前期資料調(diào)研、篩選色譜柱、確定檢測波長、確定流動相體系及供試品濃度的確定五個方面對復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)的開發(fā)進(jìn)行了闡述，對有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)尤其是復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)方法的提供了清晰的思路。