賈培建

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 301700

2015年中國藥典致力于確定四種藥物微生物限度的方法，符合歐洲和美國標(biāo)準(zhǔn)。他的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，特別是方法的適用性測(cè)試，自2010年版以來發(fā)生了重大變化。根據(jù)對(duì)測(cè)試的四個(gè)非無菌產(chǎn)品的微生物限量標(biāo)準(zhǔn)（在1105總則，一般原則1106），以確定該產(chǎn)品的微生物限度方法的限制的方法中國藥典2015年版已定，而該方法應(yīng)用到三個(gè)產(chǎn)品批次經(jīng)過測(cè)試。結(jié)果表明該方法是有效的。并且可能。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DL-CJ-2ND超凈工作臺(tái)(哈東聯(lián))；1300SERIESA2生物安全柜(Thermo)；MIR-254型生化培養(yǎng)箱(SANYO)；電熱脈動(dòng)真空滅菌器(山東新華)；PL2002電子天平(梅特勒)；MaxQ6000恒溫?fù)u床(Thermo)。

1.2 試藥

地拉羅司分散片(國內(nèi)A廠家，批號(hào)：108/109/903；規(guī)格：500mg)。

1.3 培養(yǎng)基

從胰臟豆粕液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151210），胰蛋白酶Sojaagarmedium（TSA，批號(hào)：151210），補(bǔ)充有葡萄糖沙氏液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151210），Sabur葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)）：151210），MacKangkai液體培養(yǎng)基（批號(hào)：151210），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：151210）購自北京路橋技術(shù)有限公司購買；pH為7.0氯化物胨緩沖液：百分之0.9氯化鈉（稀釋劑，北京路橋科技有限公司，批號(hào)141213）注射（4種藥物石家莊，批號(hào)：1501273201），緩沖液，pH 7的0氯化物蛋白胨（含有百分之3聚山梨酯80和百分之0.3大豆）卵磷脂，批號(hào)：151217）。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B)63501]、白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F)98001]、黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC(F)98003]、大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B)44102]均為第3代，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

在10ml胰蛋白酶大豆根液體培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種在33℃24小時(shí)，接種白珍珠新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)在10與葡萄糖液體三郎培養(yǎng)基中在23℃下進(jìn)行24栽培了幾個(gè)小時(shí)。上述培養(yǎng)物通過的0.9%氯化鈉注射稀釋，以制備含有1~50 CFU和每1ml細(xì)菌的5000至10000 CFU細(xì)菌懸浮液。黑曲霉的新鮮培養(yǎng)在23℃下接種的Sabouraud右旋糖瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天，加入含有0.05%聚山梨醇酯803毫升0.9%氯化鈉溶液，孢子被洗脫和菌絲過濾以吸出孢子。將懸浮液置于無菌管中并用含有0.05%聚山梨醇酯和0.9%氯化鈉注射液，稀釋，以制備每毫升注射液含菌數(shù)量可以達(dá)到30 CFU到60CFU細(xì)菌懸浮液和每毫升注射液含菌數(shù)量可以達(dá)到3000到6000CFU 的細(xì)菌懸浮液。

2.2 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查

取1毫升（30~100 CFU），金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和黑曲霉，其制備根據(jù)在無菌托盤，并倒入TSA培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察實(shí)驗(yàn)，混合，固化，并在33攝氏度的溫度下栽培。金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)3天，白色念珠菌和黑曲霉是5天前培養(yǎng)。包括：1毫升（30~100 CFU）從白色念珠菌和黑曲霉中的每個(gè)制備的溶液服用，在無菌托盤給予，立即倒入SDA介質(zhì)，預(yù)拌兩個(gè)板為平行和硬化測(cè)試的每種菌株。將細(xì)胞培養(yǎng)5天，在23℃，并在該測(cè)試培養(yǎng)基用用于上述測(cè)試的相應(yīng)的控制培養(yǎng)基替換同時(shí)計(jì)數(shù)。當(dāng)平均數(shù)目在培養(yǎng)基中的菌落的比例是在0.5~2范圍內(nèi)進(jìn)行控制介質(zhì)菌落的平均數(shù)，并且符合與對(duì)照培養(yǎng)基中的集落的形態(tài)，該介質(zhì)的適用性符合的要求測(cè)試。

2.2.2 供試液制備

取本品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1:10的供試液，即為供試液A。取本品10g，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，振搖至供試品分散均勻，制成1:10的供試液。取1:10的供試液20mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液80mL，即為1:50的供試液，取1:50的供試液10mL，加含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL，即為1:500的供試液。

2.3 常規(guī)法

采用常規(guī)平皿法篩查供試品有無抑制微生物生長(zhǎng)的作用和抑制的微生物種類。菌液對(duì)照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL，加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL（細(xì)菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu），混勻，使每1mL稀釋液中含菌量為30~100cfu。分別取此菌液1mL注皿，測(cè)定其每毫升的活菌數(shù)。試驗(yàn)組：取供試液A10mL和制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測(cè)定需氧菌總數(shù)。另取供試液A10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。供試品對(duì)照組：取“2.2.2”項(xiàng)下1:10的供試液10mL，加入稀釋劑0.1mL，混勻，取1mL注皿，在相應(yīng)的條件下培養(yǎng)，測(cè)定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.4 稀釋法和中和法聯(lián)用

中國藥典2015年版規(guī)定消除供試品抑菌性的主要方法包括稀釋法、中和法、薄膜過濾法以及上述方法的聯(lián)用。為了便于操作，本試驗(yàn)僅改進(jìn)了供試液的制備，選擇了稀釋法和中和法聯(lián)用，即將中和劑聚山梨酯80和大豆卵磷脂添加到稀釋液中，結(jié)合供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，將供試品稀釋為1:50和1:500。試驗(yàn)組：取1:500的供試液10mL和制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測(cè)定需氧菌總數(shù)。另取1:50供試液10mL和上述制備好的真菌菌液0.1mL，混勻，取1mL注皿，測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。供試品對(duì)照組：取“2.2.2”項(xiàng)下1:500和1:50的供試液10mL，加入稀釋劑0.1mL，混勻，取1mL注皿，在相應(yīng)的條件下培養(yǎng)，測(cè)定供試品本底的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：取含3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL，加入制備好的試驗(yàn)菌液0.1mL(細(xì)菌、酵母菌500~1000cfu，霉菌300~600cfu)，混勻，使每1mL稀釋液中含菌量30~100cfu。分別取此菌液1mL注皿，測(cè)定其每毫升的活菌數(shù)[1]。

3 討論

微生物限度檢查方法學(xué)適用性試驗(yàn)時(shí)采取常規(guī)平皿法，發(fā)現(xiàn)該藥品對(duì)微生物有較強(qiáng)的抑制作用，按照中國藥典2015年版的要求嘗試了幾種方法消除抑菌性，結(jié)合固體口服制劑的限度標(biāo)準(zhǔn)，如果僅采用稀釋法，抑菌性不能消除，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合使用了中和法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，地拉羅司別稱4-3,5-二(2-羥基苯基)-1,2,4-三唑-1-基]苯甲酸，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的特性，決定其具有抑菌性。由于苯甲酸本身主要用于抗真菌及消毒防腐，在進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)時(shí)，采用常規(guī)方法和常規(guī)的稀釋劑(pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)無法去除抑菌作用，因此，考慮使用稀釋法和中和劑(3%聚山梨酯80和0.3%大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)聯(lián)用的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果各試驗(yàn)菌株回收率比值達(dá)到藥典要求的0.5~2.0之間。

考慮到平皿法比薄膜過濾法操作方便、簡(jiǎn)捷，因此本試驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)方法采用稀釋法和中和法聯(lián)用，控制菌檢查采用稀釋的方法進(jìn)行。本研究可為不同來源的地拉羅同類產(chǎn)品微生物限度檢查提供參考。