,*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.中國科學(xué)院海洋研究所,山東青島 266071)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)是一種藥食兩用的褐藻,是我國五種大型養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)海藻之一[1]。羊棲菜的野生資源在我國分布廣泛,主要生長在遼東半島、山東、浙江、福建、廣東以及雷州半島等沿海海域,其中浙江省洞頭縣是我國最主要的養(yǎng)殖基地,被稱為“中國羊棲菜之鄉(xiāng)”。羊棲菜富含多種活性成分,如褐藻糖膠,巖藻黃素,褐藻多酚等。課題組前期研究中,制備了羊棲菜的多酚(SFPC)粗提物,其多酚含量高達(dá)88.48±0.30 mg/100 mg,高于其他眾多褐藻[2]。褐藻多酚(phenolic compounds,PC)通過乙酸-丙二酸途徑,以間苯三酚(1,3,5-三羥基苯)為基本結(jié)構(gòu)單元,通過不同聚合度和連接方式,構(gòu)成一類含有酚羥基的次級代謝產(chǎn)物[3]。近年來褐藻多酚的生物活性逐漸被關(guān)注,例如抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]、美白、抑菌[7]等。Cha等[8]從Ecklonia cava中分離出四種褐藻多酚通過評估UVB輻射誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的斑馬魚體內(nèi)模型,發(fā)現(xiàn)褐藻多酚能顯著減少斑馬魚胚胎中的活性氧和NO產(chǎn)生水平,并能保護(hù)胚胎、減少色素沉著。Yoon等[9]從E. cava分離出的phloroglucinol,dioxinodehydroeckol和7-phloroeckol對B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶有明顯的抑制作用。以上研究說明,褐藻多酚在抵抗外界不利因素,如紫外線、腫瘤和老年癡呆等方面具有較強(qiáng)的活性。課題組前期體外巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SFPC具有良好抗炎活性,在200 μg/mL濃度下,NO抑制率可達(dá)47.2%,抑制活性高于現(xiàn)有抗炎藥地塞米松[10]。但目前缺乏羊棲菜多酚體內(nèi)抗炎活性的研究報道,使其高值化應(yīng)用受限。

活性氧(ROS)和NO在免疫系統(tǒng)信號傳遞中至關(guān)重要,但過量的ROS和NO也會導(dǎo)致多種生理生化損害,破壞機(jī)體正常代謝功能,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織炎癥[11-14]。熒光探針染料2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)和4-氨基-5-甲氨基-2,7-二氟熒光素二乙酸酯(DAF-FM DA)可被胞內(nèi)酯酶水解成不能透過細(xì)胞膜的DCFH和DAF-FM。細(xì)胞內(nèi)ROS在過氧化物酶存在下氧化DCFH生成有熒光的二氯熒光素(DCF)[15],DAF-FM與NO反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)熒光[16],熒光強(qiáng)度可顯示機(jī)體細(xì)胞內(nèi)ROS和NO的相對水平。

斑馬魚(Daniorerio)是一種硬骨魚,屬于幅鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚屬[17]。由于其個體小,繁殖能力強(qiáng),養(yǎng)殖成本低,胚胎透明,易于實(shí)驗(yàn)觀察等優(yōu)勢被遺傳學(xué)、人類疾病研究、藥物研發(fā)等領(lǐng)域列為模式生物[18-21]。近年來,已有利用斑馬魚模型評價海洋褐藻多糖、多酚等物質(zhì)生物活性的相關(guān)研究報道[22-23],但未見利用斑馬魚模型研究SFPC抗炎活性的報道。

本實(shí)驗(yàn)在課題組前期利用巨噬細(xì)胞模型研究體外抗炎活性的基礎(chǔ)上,首次利用斑馬魚炎癥模型,研究SFPC的體內(nèi)抗炎活性,為其在功能性食品和化妝品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜(于2014年5月收獲自浙江省洞頭縣);成年野生AB系斑馬魚 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院分子醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;脂多糖(LPS),吖啶橙,4-氨基-5-甲氨基-2,7-二氟熒光素二乙酸酯(DAF-FM DA),三卡因,2,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA) 美國sigma公司;氯化鈉,氯化鉀,氯化鈣,硫酸鎂,鹽酸,亞甲基藍(lán) 分析級,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胚胎培養(yǎng)液(10% NaCl,0.3% KCl,0.3% CaCl2,0.79% MgSO4,0.1%亞甲基藍(lán))。

斑馬魚全自動循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng) 北京愛生科技發(fā)展有限公司;SZ61體式顯微鏡 日本奧林巴斯;DMI 6000B倒置熒光顯微鏡 德國Leica 公司;Milli Q純水機(jī) 默克密理博實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司;FA2004B電子天平 上海天美天平儀器有限公司;冷凍干燥機(jī)FD5-2.5 北京金西盟儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SFPC的制備 SFPC的制備方法參考Li等[2]的報道。羊棲菜用蒸餾水沖洗干凈,冷風(fēng)干燥后,粉碎后過60目篩得羊棲菜海藻干粉,于-20 ℃保存。將海藻干粉按料液比1∶30加入30%乙醇中,在25 ℃的恒溫震蕩搖床中震蕩提取30 min后過濾,取上清加入等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,將乙酸乙酯旋蒸除去,加入少量蒸餾水復(fù)溶,凍干后存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.2 斑馬魚喂養(yǎng)及胚胎收集 成年野生AB系斑馬魚飼養(yǎng)于全自動循環(huán)系統(tǒng)中,水溫設(shè)置為(26±1) ℃,照明按14 h/10 h(光照/黑暗)交替進(jìn)行,每日以豐年蝦(鹵蟲)于早晚各飼喂一次[24]。實(shí)驗(yàn)用胚胎由健康雌雄魚自然交配獲得。收集數(shù)百枚胚胎于干凈培養(yǎng)皿中并及時移除排泄物、雜質(zhì)及未受精胚胎,加入胚胎培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 h,備用。

1.2.3 胚胎給藥 篩選受精且發(fā)育至7～9 hpf(hours post fertilization)時期斑馬魚胚胎,移入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔15枚胚胎,除去殘留培養(yǎng)液后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計,LPS誘導(dǎo)組每孔分別加入終濃度為5、8、10、16、20 μg/mL的LPS,實(shí)驗(yàn)組為LPS+終濃度為50、100、200 μg/mL的SFPC活性物,SFPC用二甲亞砜(DMSO)配制成高濃度貯液,用時用胚胎培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度工作液且各組中DMSO濃度低于0.5%;空白對照組為含0.5%DMSO的胚胎培養(yǎng)液,給藥方式均是將誘導(dǎo)物或活性物溶于胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行浸泡處理,每個濃度3個孔(平行)[24]?；钚晕锘蛘T導(dǎo)物給藥后,將24孔板轉(zhuǎn)移于(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)且每日更換培養(yǎng)液,待后續(xù)觀察及檢測。

1.2.4 LPS誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)報道[23,25],選擇不同濃度(5、8、10、16、20 μg/mL)LPS,進(jìn)行單因素的炎癥誘導(dǎo)模型優(yōu)化。對受精且發(fā)育至8～9 hpf胚胎給藥,72 hpf時期進(jìn)行存活率、心跳速率、ROS生成率的檢測。

1.2.5 SFPC抗炎活性評價 選擇無毒性的羊棲菜安全濃度[10]于7～8 hpf進(jìn)行胚胎給藥,在(28.5±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)孵育1 h,然后直接加入終濃度8 μg/mL的LPS誘導(dǎo)濃度進(jìn)行炎癥誘導(dǎo),48 hpf進(jìn)行卵黃囊大小的檢測,72 hpf時期進(jìn)行胚胎存活率、心跳速率、細(xì)胞死亡率、ROS生成率和NO生成率[12]的檢測。

1.2.6 指標(biāo)測定

1.2.6.1 斑馬魚存活率統(tǒng)計 參考Kim等[26]的報道,各實(shí)驗(yàn)組加藥后注意每日8:30～22:00,每隔2 h觀察胚胎發(fā)育狀況,及時移除死亡胚胎并記錄,統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育至72 hpf時期存活率情況。

存活率(%)=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100

1.2.6.2 幼魚卵黃囊大小測定 參考Lee等[23]的報道對各組出膜幼魚進(jìn)行卵黃囊大小測定。實(shí)驗(yàn)幼魚胚胎達(dá)48 hpf時期(徹底脫膜后),用帶攝像頭的體式顯微鏡(25×)對擺位后的幼魚拍照并計算各組與空白組卵黃囊大小之比。

卵黃囊大小(%)=給藥組卵黃囊面積/空白組卵黃囊面積×100

1.2.6.3 幼魚心跳速率檢測 參考Wijesinghe等[27]的報道對各組出膜幼魚進(jìn)行心跳速率統(tǒng)計。實(shí)驗(yàn)幼魚胚胎達(dá)48 hpf時期(徹底脫膜后),對各組幼魚心跳進(jìn)行30 s人工計數(shù)(注意環(huán)境溫度在28.5±1 ℃的恒溫條件下),并計算各組與空白組心跳速率之比。

1.2.6.4 斑馬魚幼魚體內(nèi)熒光染色及各熒光強(qiáng)度的分析 參考鄒婭雪等[28]的報道,對各組胚胎發(fā)育至72 hpf幼魚時期,隨機(jī)選擇各組胚胎數(shù)條對其進(jìn)行熒光染色。熒光染料包括觀察幼魚體內(nèi)ROS水平變化的DCFH-DA、觀察幼魚體內(nèi)NO水平變化的DAF-FM DA以及觀察幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的吖叮橙。28.5±1 ℃的恒溫條件下,利用DCFH-DA(20 μg/mL)、DAF-FM DA(20 μg/mL)和吖啶橙(7 μg/mL)對各組幼魚分別避光染色孵育1 h、2 h和30 min。染色孵育后,先用胚胎培養(yǎng)液洗滌幼魚3～5次,后用0.03%三卡因麻醉幼魚,最后將幼魚置于熒光顯微鏡下捕獲相應(yīng)熒光圖片,并用image J軟件分析、統(tǒng)計相對熒光強(qiáng)度。

ROS生成率/NO生成率/細(xì)胞死亡率(%)=給藥組熒光強(qiáng)度/空白組熒光強(qiáng)度×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,結(jié)果以means±S.D表示,通過one-way ANOVA對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,運(yùn)用多重比較Turkey檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的差異性。所示結(jié)果中,P<0.05判斷為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 LPS誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響 如圖1所示,空白組胚胎存活率為100%,且各組行間均無死亡。經(jīng)過不同實(shí)驗(yàn)濃度LPS處理后,均導(dǎo)致了一定數(shù)量的胚胎死亡現(xiàn)象,且胚胎存活率與LPS誘導(dǎo)濃度呈劑量依賴性下降。LPS誘導(dǎo)濃度在5 μg/mL時,誘導(dǎo)組胚胎的存活率與空白組無顯著性差異(P>0.05);而當(dāng)濃度高于8 μg/mL時,誘導(dǎo)組胚胎的存活率與空白組表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05);且在高濃度(16、20 μg/mL)時,胚胎存活率降至20%和2%,死亡率較高,因此選擇LPS終濃度為5、8、10 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 LPS誘導(dǎo)濃度對斑馬魚胚胎存活率的影響Fig.1 Effect of LPS-induced concentrationon the survival rate of zebrafish embryo

2.1.2 LPS誘導(dǎo)濃度對斑馬魚心跳速率及ROS生成率的影響 對可以滿足后續(xù)炎癥造模指標(biāo)的各誘導(dǎo)濃度組進(jìn)行心跳速率和ROS生成率的測定,心跳速率結(jié)果如圖2所示,LPS誘導(dǎo)組加快了幼魚心跳速率,表明LPS在該濃度梯度下,斑馬魚出現(xiàn)炎癥表型。在LPS濃度為8 μg/mL時,與空白組相比,斑馬魚心跳速率提高至117.82%(P<0.05),心跳速率最快,炎癥反應(yīng)最顯著。

圖2 LPS誘導(dǎo)濃度對斑馬魚心跳速率的影響Fig.2 Effect of LPS-induced concentrationon the heart-beating rate in vivo

LPS誘導(dǎo)濃度為5、8、10 μg/mL對斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS水平的影響結(jié)果如圖3所示。由圖可知,未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的空白組斑馬魚體內(nèi)的熒光強(qiáng)度較弱,ROS水平較低,當(dāng)給予斑馬魚一定濃度的LPS 誘導(dǎo)后,其體內(nèi)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),ROS水平增高,即一定濃度的LPS誘導(dǎo)提高了斑馬魚幼魚體內(nèi)的ROS水平。在此研究中,8 μg/mL LPS誘導(dǎo)濃度可極顯著提高斑馬魚體內(nèi)的ROS水平近4倍,與Fernando等[29]報道利用10 μg/mL LPS誘導(dǎo)的ROS水平相當(dāng),是本研究中LPS誘導(dǎo)炎癥造模的最優(yōu)濃度。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)LPS濃度8 μg/mL進(jìn)行炎癥造模誘導(dǎo)。

2.2 SFPC抗炎活性評價結(jié)果

2.2.1 不同濃度SFPC對斑馬魚卵黃囊大小的影響 斑馬魚從胚胎到幼魚時期無需其他營養(yǎng)供給,可僅利用卵黃囊中營養(yǎng)存活至7 d[30],因此,卵黃囊大小對胚胎發(fā)育至關(guān)重要。由圖4可知,LPS誘導(dǎo)組的胚胎48 h后發(fā)育遲緩,卵黃消耗少,卵黃囊大小比空白組大1.279倍,差異顯著(P<0.05)。而SFPC處理組的卵黃囊大小隨著其濃度的增加逐漸降低,直至高劑量組下與空白組無顯著性差異(P>0.05),說明SFPC能抑制LPS誘導(dǎo)造成的胚胎發(fā)育緩慢的炎癥反應(yīng),提高胚胎發(fā)育速度,使卵黃消耗逐漸恢復(fù)正常,表明SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥反應(yīng)造成的發(fā)育遲緩有抑制作用,進(jìn)一步證明SFPC能在斑馬魚胚胎受到LPS等外界刺激時起到積極的保護(hù)作用。

圖3 LPS誘導(dǎo)濃度對斑馬魚體內(nèi)ROS生成率的影響Fig.3 Effect of LPS-induced concentration on the ROS production rate in vivo

圖4 不同濃度多酚對斑馬魚胚胎卵黃囊大小的影響Fig.4 Effect of different concentrations of phenolic compounds on the yolk sac size of LPS-induced zebrafish embryos注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

2.2.2 不同濃度SFPC對斑馬魚胚胎存活率和心跳速率的影響 圖5是不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活率的結(jié)果。從圖5中可以看出,與空白對照組相比,LPS誘導(dǎo)后的72 hpf胚胎存活率顯著下降至30%左右(與圖1無差異),而不同濃度SFPC預(yù)處理后,胚胎存活率呈劑量依賴性升高。當(dāng)SFPC濃度達(dá)到200 μg/mL時,其存活率達(dá)到66.67%。以上結(jié)果表明,SFPC對LPS引起的斑馬魚炎癥胚胎損傷有保護(hù)作用,且隨濃度增加,保護(hù)作用增強(qiáng)。

圖5 不同濃度多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎存活率的影響Fig.5 Effect of different concentration of phenolic compoundson the survival rate of LPS-induced zebrafish embryos注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚心跳速率的結(jié)果如圖6所示。由圖可知,LPS誘導(dǎo)組幼魚的心跳速率明顯高于空白對照組,而SFPC處理組則降低了幼魚心跳速率,且當(dāng)SFPC濃度為200 μg/mL時,其心跳速率已與正常組無顯著性差異(P>0.05)。Wijesinghe等[27]從Laurencia snackeyi提取出來的5β-Hydroxypalisadin B也具有降低LPS誘導(dǎo)的斑馬魚心跳速率增加的效果,被認(rèn)為是一種潛在有效的抗炎藥。因此,SFPC也具有較強(qiáng)的抗炎活性,可能作為一種潛在的天然抗炎成分。

圖6 不同濃度多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的心跳速率的影響Fig.6 Effects of different concentrations of phenolic compoundson the heart-beating rate of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

圖7 不同濃度多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的細(xì)胞死亡的影響Fig.7 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the cell death of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

圖8 不同濃度多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的ROS產(chǎn)生量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the ROS production of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

2.2.3 不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚細(xì)胞死亡的影響 研究表明,細(xì)胞死亡對機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持有影響,過度的細(xì)胞死亡會破壞機(jī)體穩(wěn)態(tài),已有證據(jù)表明細(xì)胞死亡釋放的大量細(xì)胞內(nèi)溶物可激活免疫系統(tǒng)并引發(fā)炎癥[31]。圖7是不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)后斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響,其中左圖為用吖啶橙對存活幼魚的體內(nèi)細(xì)胞死亡的特異性染色。由圖可知,LPS誘導(dǎo)后的幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率顯著性(P<0.05)高于空白組,而用50、100、200 μg/mL SFPC預(yù)孵育后,幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率降低并呈劑量依賴性。從熒光圖像中可明顯看出,空白組幼魚只有少量細(xì)胞被熒光染料染色,熒光強(qiáng)度較弱,而LPS誘導(dǎo)組幼魚體內(nèi)大量細(xì)胞結(jié)合了熒光染料,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),當(dāng)預(yù)孵育SFPC后則濃度依賴性的改善了幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡狀況,抑制了組織中炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步增強(qiáng),表現(xiàn)出良好的抗炎活性。從E. cava中[26]提取的多酚也濃度依賴性降低LPS誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚體內(nèi)細(xì)胞死亡率。

2.2.4 不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚ROS生成率的影響 圖8是不同濃度SFPC對斑馬魚ROS的影響,其中,左圖為不同條件下斑馬魚的熒光圖片,由圖可見,正常組斑馬魚體內(nèi)僅有少量ROS,而LPS誘導(dǎo)后斑馬魚體內(nèi)ROS水平明顯升高,而預(yù)孵育50 μg/mL SFPC時即表現(xiàn)出對ROS的顯著性抑制(P<0.05),當(dāng)SFPC濃度在200 μg/mL時幼魚體內(nèi)ROS水平已與正常組無顯著性差異(P>0.05),各實(shí)驗(yàn)濃度呈現(xiàn)劑量依賴性抑制作用。Kim等人[26]檢測從E. cava中富集的多酚組分,也發(fā)現(xiàn)其對LPS誘導(dǎo)的炎癥斑馬魚的ROS產(chǎn)生量有顯著的劑量依賴性抑制作用。這說明從不同海藻中提取的多酚可能具有相似的抗炎活性,都是良好的天然抗炎成分。

2.2.5 不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚NO生成率的影響 圖9是不同濃度SFPC對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的NO產(chǎn)生量的影響。由圖可知,LPS誘導(dǎo)后斑馬魚幼魚體內(nèi)產(chǎn)生了大量的NO,NO與相應(yīng)熒光染料反應(yīng),表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光現(xiàn)象,其熒光強(qiáng)度可達(dá)空白組2倍左右,而SFPC預(yù)處理后劑量依賴性的降低了幼魚體內(nèi)的NO水平,且100和200 μg/mL的SFPC作用下,斑馬魚NO產(chǎn)生量與空白組無顯著性差異(P>0.05),基本恢復(fù)到正常水平。橄欖苦苷是存在于橄欖葉的主要酚類化合物之一,Ryu等[32]從橄欖葉中提取了陸地多酚橄欖苦苷,通過體內(nèi)斑馬魚炎癥模型發(fā)現(xiàn),其能有效地降低LPS誘導(dǎo)在NO產(chǎn)生,在高濃度300 μmol/L時抑制率達(dá)到62%,抗炎效果良好。而從羊棲菜中提取的褐藻多酚在高濃度200 μg/mL時也達(dá)到62.65%的抑制率,這表明SFPC和陸地多酚具有相似的抗炎活性。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SFPC具有良好的抗炎活性,其最優(yōu)濃度為200 μg/mL。該結(jié)果與Kim[26]等利用同一模型研究的昆布多酚的抗炎活性相似。

圖9 不同濃度多酚對LPS誘導(dǎo)的斑馬魚的NO產(chǎn)生量的影響Fig.9 Effects of different concentrations of phenolic compounds on the NO production of LPS-induced zebrafish注:+即前期給藥;-即前期未給藥。

目前,利用斑馬魚模型進(jìn)行抗炎活性研究已被大量報道,Hwang等[33]利用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)模型證明咖啡因具有明顯的抗炎活性。Sun等[34]利用LPS誘導(dǎo)炎癥研究反式-1,3-二苯基-2,3-環(huán)氧丙烷-1-酮的抗炎機(jī)制的結(jié)果表明,該物質(zhì)可明顯降低斑馬魚體內(nèi)ROS和NO產(chǎn)生量,同時以劑量依賴性降低iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。有研究表明機(jī)體內(nèi)的一系列病理過程都與ROS的產(chǎn)生有關(guān),ROS的過量產(chǎn)生會導(dǎo)致細(xì)胞損傷或炎癥發(fā)生[35-36],在本研究中,經(jīng)LPS誘導(dǎo)后,斑馬魚體內(nèi)ROS和NO含量明顯升高,但預(yù)孵育SFPC后,體內(nèi)ROS水平明顯降低,同時體內(nèi)NO水平也顯著降低,因此SFPC的抗炎活性可能與其抗氧化活性有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究通過不同誘導(dǎo)濃度優(yōu)化得到8 μg/mL LPS誘導(dǎo)的最優(yōu)斑馬魚炎癥模型,利用該模型探討了SFPC的抗炎活性。一定濃度的SFPC(50、100、200 μg/mL)以劑量依賴性降低LPS誘導(dǎo)后斑馬魚體內(nèi)NO和ROS的產(chǎn)生,提高胚胎存活率、降低卵黃囊大小及心跳速率。當(dāng)濃度為200 μg/mL時,斑馬魚胚胎存活率由30%提高至66.67%,顯著降低由LPS誘導(dǎo)所導(dǎo)致的心跳速率和卵黃囊大小的增加,而且NO和ROS生成率降低至75.62%和128.91%,與正常組無顯著性差異,表現(xiàn)出良好的抗炎活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為SFPC作為一種天然的抗炎劑提供了理論依據(jù)。