杜 凱,馬養(yǎng)民,2,*,郭林新

(1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,陜西西安 710021;2.陜西省輕化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710021)

山杏(Armeniacasibirica)又名西伯利亞杏,薔薇科杏屬植物,廣泛分布于我國北方地區(qū),是改善生態(tài)環(huán)境、提高經(jīng)濟(jì)效益和社會效益的經(jīng)濟(jì)資源樹種[1]。由于杏仁具有鎮(zhèn)咳平喘、潤腸通便、抗炎鎮(zhèn)痛的效果及抗腫瘤、降血糖、抑制胃蛋白酶活性等藥理作用[2-3],杏仁加工產(chǎn)品的種類和數(shù)量快速增加,作為杏仁產(chǎn)業(yè)的下腳料杏仁皮也越來越多,這已經(jīng)成為杏仁加工企業(yè)很難處理的苦惱問題。目前研究主要集中在杏仁皮黃酮、黑色素、果膠等方面[4-6],而杏仁皮單寧相關(guān)的研究還未見報道。

單寧是一類分子量為500～3000的多元酚類化合物,廣泛存在于植物的果、葉、皮中[7]。單寧可以與蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀[8],廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、皮革和化妝品等行業(yè)[9-10]。有關(guān)山杏單寧的研究鮮有報道,且僅限于其葉片單寧的提取及單寧成分的分析檢測[11-13]。經(jīng)過前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杏仁皮中富含單寧,杏仁皮作為工業(yè)生產(chǎn)的廢棄資源,尚未被開發(fā),如能將其加以利用,將會帶來極大的社會經(jīng)濟(jì)效益。

本研究以杏仁加工企業(yè)所產(chǎn)生的廢棄物杏仁皮為原料,進(jìn)行單寧的提取,旨在建立一條最優(yōu)的杏仁皮單寧提取工藝,并對其單寧抗氧化活性進(jìn)行初步測試,為資源充分開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏仁皮 陜西天壽杏仁食品有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基) 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司;維生素C 天津博迪化工有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

HF200型酶標(biāo)儀 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;DK-98Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋 上海申生科技有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 上海申生科技有限公司;BS2202S電子秤 北京市科技電光儀器廠;BS224S型分析天平 格瑞恩科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杏仁皮單寧提取 采用水浴回流法提取杏仁皮單寧[14]。稱取5 g杏仁皮粗粉于圓底燒瓶中,加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,一定溫度下回流提取一段時間,過濾,重復(fù)提取三次,合并濾液,將其真空濃縮后待測。

1.2.2 單寧得率的測定 采用絡(luò)合法測定單寧得率[15]。取待測濃縮液加水約至60 mL于35 ℃水浴溫?zé)?5 min。精密移取4.00 mL 1.000 mol/L醋酸鋅溶液于100 mL容量瓶中,加入2.80 mL氨水,搖勻使白色沉淀溶解,緩慢加入已預(yù)熱的待測濃縮液,邊加邊搖,加完后繼續(xù)振搖1 min,置原水浴保溫30 min,間歇振搖數(shù)次,待反應(yīng)完畢,冷卻至室溫,定容,混勻后過濾,精密移取濾液10.00 mL于錐形瓶中,并加入150 mL水、12.5 mL pH=10的NH3-NH4Cl緩沖溶液和3滴鉻黑T指示劑。以0.02631 mol/L EDTA·2Na滴定至溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。單寧得率按下式計算:

單寧得率(%)=[0.1556×(VZn×CZn-10×VEDTA×CEDTA)]/W×100

式中:0.1556指每毫升1 mol/L的醋酸鋅溶液平均消耗單寧0.1556 g;VZn為移取鋅離子體積量,mL;CZn為鋅離子物質(zhì)的量濃度,mol/L;VEDTA為EDTA消耗體積,mL;CEDTA為EDTA濃度,mol/L;W為樣品的質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 固定提取時間90 min、提取溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,考察提取時間30、60、90、120、150 min對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取時間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,考察提取溫度40、50、60、70、80 ℃對單寧得率的影響;固定料液比1∶20 (g/mL)、提取時間90 min、提取溫度70 ℃,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、70%對單寧得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以杏仁皮單寧的得率為響應(yīng)值,以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個因素為自變量進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計,優(yōu)化杏仁皮單寧提取工藝,其實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 杏仁皮單寧抗氧化活性測試 采用DPPH法測定[16],用95%乙醇配制成濃度為0.2 mg/mL的DPPH溶液。將最佳工藝下所得的杏仁皮單寧配制成單寧濃度為0.5 mg/mL的待測液,同時以VC作陽性對照。用二倍稀釋法得到待測液濃度依次為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 μg/mL,然后將待測液分別與DPPH溶液避光反應(yīng)30 min,在517 nm處使用酶標(biāo)儀測定溶液的吸光度。并通過下式計算DPPH自由基清除率。

式中:E為自由基清除率;A0為DPPH加乙醇的吸光度;A1為DPPH加樣品的吸光度;A2為樣品加乙醇的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖,SPSS 21.0軟件的單因素方差進(jìn)行變量之間差異的統(tǒng)計分析(當(dāng)P<0.05時,差異顯著)。使用Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析

2.1.1 料液比對杏仁皮單寧得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的降低,杏仁皮單寧的得率顯著(P<0.05)增加,當(dāng)料液比到達(dá)1∶20 (g/mL)之后,得率還有微小的增加趨勢,到1∶25 (g/mL)時已趨于穩(wěn)定。這是由于溶劑用量的增加有利于單寧的提取,但達(dá)到一定比例后,大部分單寧已經(jīng)被溶出,繼續(xù)增加溶劑時,單寧得率增加不再明顯,而且會造成溶劑的浪費(fèi)。

圖1 料液比對杏仁皮單寧得率的影響Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of tannins

從成本與得率方面考慮,選擇料液比范圍為1∶18～1∶24 (g/mL)為宜。

2.1.2 提取時間對杏仁皮單寧得率的影響 由圖2可知,提取時間在30～90 min之內(nèi)單寧得率隨時間的延長而增加,當(dāng)提取時間為90 min時單寧得率達(dá)到最大值1.62%,而提取時間繼續(xù)增加時單寧得率有所降低。原因可能是單寧屬于多酚類化合物,其結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定,隨著提取時間的延長部分單寧變性導(dǎo)致[17-18]。綜合考慮,后續(xù)提取時間控制在70～110 min較為合適。

圖2 提取時間對杏仁皮單寧得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of tannins

2.1.3 提取溫度對杏仁皮單寧得率的影響 由圖3可知,提取溫度在40～70 ℃時,單寧得率隨溫度的升高而增加,70 ℃時單寧得率達(dá)到最高值為1.83%,這可能是由于分子運(yùn)動速度隨溫度的升高而加快,植物中氫鍵也隨之?dāng)嗔?。?dāng)溫度達(dá)到80 ℃時,單寧的熱不穩(wěn)定性使單寧得率降低[17]。因此,提取溫度控制在60～80 ℃為宜。

圖3 提取溫度對杏仁皮單寧得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of tannins

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對杏仁皮單寧得率的影響 由圖4可知,乙醇的體積分?jǐn)?shù)對單寧得率影響較大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～50%時,單寧得率由1.32%增加到2.11%;在乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50%時,達(dá)到最高值;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%時單寧得率不斷下降。這可能是極性過大時,乙醇用量較低,則無法斷裂單寧與多糖、蛋白質(zhì)間的氫鍵;極性過小時,無法充分溶解單寧類成分[19]。綜合考慮,乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇45%～65%比較合適。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對杏仁皮單寧得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the yield of tannins

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計及分析 在單因素基礎(chǔ)上,以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)為考察因素,單寧得率(Y)為指標(biāo),利用Design-Expert V 8.0.6軟件設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合,得到回歸方程:

Y=2.11+0.025A-4.167E-003B-0.011C-0.027D+0.010AB+0.015AD+0.015BC+2.500E-003BD-0.028CD-0.070A2-0.084B2-0.18C2-0.17D2

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface methodology design and results

表3 模型及方差分析結(jié)果Table 3 Results of model and variance analysis

響應(yīng)面圖可以用來分析多個因素對響應(yīng)值的影響程度和兩因素之間的交互作用。響應(yīng)面的陡峭程度直觀的反映了兩因素的交互作用對響應(yīng)值的敏感程度[20]。由圖5知,乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用下,曲面較陡,表明其交互作用顯著,這與方差分析相一致。并且,預(yù)測最高值均在曲面中心區(qū)域內(nèi),表明該模型擬合度較好,可預(yù)測最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果[21]。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert V 8.0.6軟件預(yù)測得到的杏仁皮單寧最佳提取工藝是料液比為1∶21.51 (g/mL)、提取時間為89.43 min、提取溫度為69.73 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為49.65%,單寧得率為2.12%。為了方便進(jìn)行實(shí)驗(yàn),調(diào)整最佳參數(shù)料液比為1∶22 (g/mL)、提取時間為89 min、提取溫度為70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。此實(shí)驗(yàn)平行三次,得出杏仁皮單寧得率為2.13%,與預(yù)測值接近。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用對單寧得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of the effects ofthe interaction between extraction temperatureand ethanol volume fraction on tannins extraction rate

2.2.3 DPPH自由基清除率測定結(jié)果 DPPH法是測試抗氧化活性常用的一種方法,其DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,在醇溶液中呈深紫色,它能夠接受電子或氫自由基,成為穩(wěn)定的抗磁性分子而褪色。因此,清除DPPH自由基的能力可以用來表示物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱[22]。如圖6所示,在濃度小于250 μg/mL時,單寧的自由基清除率隨濃度的增加呈上升趨勢,其對DPPH自由基的清除作用低于VC陽性對照;當(dāng)濃度達(dá)到250 μg/mL后,杏仁皮單寧對自由基的清除率趨于穩(wěn)定,與VC相當(dāng),單寧的自由基清除率達(dá)到了98.65%,證明其具有較強(qiáng)的自由基清除作用。這可能與單寧的分子結(jié)構(gòu)有關(guān),它們能提供氫,與DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)生成穩(wěn)定的DPPH-H,從而使溶液褪色[23-24]。

圖6 VC及杏仁皮單寧對DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical-scavenging activity ofVC and almond skin tannins

3 結(jié)論

本研究在單因素的基礎(chǔ)之上,采用Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計,對杏仁皮單寧得率的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了可靠的杏仁皮單寧提取的回歸模型。得出杏仁皮單寧提取工藝的最佳條件是:料液比為1∶22 (g/mL)、提取時間為89 min、提取溫度為70 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到單寧得率為2.13%,與模型預(yù)測值基本一致。對最佳工藝下提取的杏仁皮單寧進(jìn)行抗氧化活性測試,發(fā)現(xiàn)其濃度為250 μg/mL時DPPH自由基的清除率達(dá)到了98.65%,證明杏仁皮單寧具有較強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)首次在食品企業(yè)的廢棄物杏仁皮中提取得到單寧,建立可靠的工藝路線,并初步對其抗氧化活性進(jìn)行評價,為后續(xù)有效開發(fā)利用杏仁皮單寧廢棄資源提供基礎(chǔ)。