,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東青島 266071;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是一種群居生活在南極海域的小型甲殼類浮游動物[1],是地球上數(shù)量最大的單種生物資源之一[2]。調(diào)查表明,南極磷蝦的生物量約有6.5～10億噸,年可捕撈量高達(dá)0.6～1.0億噸,目前全球捕撈量已高達(dá)30萬噸[3]。Grantham等[4]研究發(fā)現(xiàn),南極磷蝦粗蛋白含量約為11.9%～15.4%,干基蛋白含量約為60%～80%,其蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的氨基酸種類豐富,所含必需氨基酸(EAA)占氨基酸總量(FAA)的40.2%,滿足FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式[5-6],是人類目前探明最大的可再生生物蛋白質(zhì)庫[2]。南極磷蝦中還富含以DHA和EHA為代表的ε-3s等藥用成分[7]以及多種礦質(zhì)元素、微量元素及蝦青素、類胡蘿卜素和脂溶性維生素等豐富的活性物質(zhì)[8],其產(chǎn)品主要應(yīng)用于食品、水產(chǎn)、飼料、營養(yǎng)品和制藥業(yè)等行業(yè)[7]。我國對南極磷蝦的整體利用尚處于初級階段,主要集中在蝦粉飼料、蝦油及蝦青素提取制備等領(lǐng)域,而對蛋白質(zhì)的利用尚不充分,易造成資源浪費(fèi)[3]。因此,對南極磷蝦蛋白的高值化利用成為目前的研究熱點之一。

鐵是維持人體生命活動的必需礦物質(zhì)元素,具有重要的生理功能,鐵缺乏可導(dǎo)致小細(xì)胞低色素貧血、成人機(jī)體活動障礙及兒童認(rèn)知障礙等多種疾病[9]。研究表明,硫酸亞鐵、氯化亞鐵、乳酸亞鐵等傳統(tǒng)補(bǔ)鐵劑存在成本高、性質(zhì)不穩(wěn)定、易造成胃腸道疾病等問題,導(dǎo)致機(jī)體對鐵的吸收利用率較低,限制了其應(yīng)用[10]。近年來隨著人們對營養(yǎng)安全的追求,食源性亞鐵螯合肽越來越受到人們的重視。食源性鐵螯合肽是指本身具有鐵螯合活性并可提高機(jī)體對鐵元素生物利用度的一類多肽。此外,食源性鐵螯合肽還具有抗氧化等多種生物活性,具有良好的市場開發(fā)前景[11-12]。

目前,研究人員已經(jīng)從太平洋鱈魚皮[13]、紅藻蛋白[12]和鳀魚肌肉[14]等多種水產(chǎn)原料中制備得到亞鐵螯合肽,而以南極磷蝦為原料制備亞鐵螯合肽的研究還尚未見報道。本研究以南極磷蝦為原料制備亞鐵螯合肽,通過單因素實驗及響應(yīng)面試驗對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對南極磷蝦亞鐵螯合肽(Antarctic krill iron-chelating peptides,AKIP)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,以期為南極磷蝦蛋白的高值化利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供,于-40 ℃冷藏;中性蛋白酶(0.8 AU/g)、Alcalase 2.4 L(2.4 AU/g) 丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶(500 U/mg)、胃蛋白酶(500 U/mg) 京博奧拓達(dá)科技有限公司;茚三酮、D-果糖、鹽酸、鄰苯三酚等(均為分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶(250 NFU/mg)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、菲咯嗪北京索萊寶科技有限公司;細(xì)胞色素 C(MW12400)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189) 美國Sigma-Aldrich公司。

XT5118-OV50電熱鼓風(fēng)干燥箱 杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司;UV-9000紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司;BSA124S-CW電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;ZHSY-50N水浴恒溫震蕩器 上海知楚儀器有限公司;SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝股份有限公司;STARTER 3C pH計 奧豪斯儀器有限公司;HH-21-4電熱恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司;N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;LC-4012低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AKIP的制備 南極磷蝦原料→滅酶→脫脂→勻漿→酶解→滅酶→離心→冷凍干燥→樣品

操作要點:滅酶:將南極磷蝦解凍后,置于高壓高溫滅菌鍋中,蒸煮20 min,冷卻至室溫。脫脂:將高溫滅酶后的南極磷蝦原料置于10%異丙醇溶液按照(1∶5,W/V)混合,不斷攪拌浸泡24 h后,沖洗抽濾多次。勻漿:將脫脂后的南極磷蝦直接勻漿,取樣時攪拌均勻。滅酶、離心:酶解結(jié)束后,將反應(yīng)液置于沸水浴中滅酶10 min,冷卻至室溫后經(jīng)4500 r/min離心15 min,收集上清液,將其置于冷凍干燥機(jī)(-80 ℃,10 Pa)中進(jìn)行冷凍干燥,得到樣品。

1.2.2 蛋白酶的篩選 準(zhǔn)確稱取15 mL脫脂后的南極磷蝦勻漿,加入15 mL蒸餾水,用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)至木瓜蛋白酶(50 ℃,pH7.0)、中性蛋白酶(50 ℃,pH7.0)、Alcalase 2.4 L(55 ℃,pH8.0)、胃蛋白酶(50 ℃,pH2.0)和胰蛋白酶(37 ℃,pH8.0)的最適pH后,按照加酶量5%(以南極磷蝦蛋白質(zhì)含量為底)加入蛋白酶進(jìn)行酶解,酶解時間為30、60、10、180、240、300、360 min。以水解度及亞鐵螯合率為評價指標(biāo),綜合篩選出水解度(Degree of hydrolysis,DH)相對較高且產(chǎn)物具有較好亞鐵螯合活性的蛋白酶,進(jìn)行下一步實驗。

1.2.3 單因素實驗 以底物蛋白濃度4 mg/mL、加酶量5%、酶解溫度55 ℃、酶解時間240 min、pH8.0為基本條件,以亞鐵螯合率和水解度為測定指標(biāo),進(jìn)一步探究酶解溫度(35、45、55、65、75 ℃)、酶解時間(120、180、240、300、360 min)、加酶量(1%、3%、5%、7%、9%)及pH(6、7、8、9、10)對亞鐵螯合率和DH的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理,以酶解溫度(X1)、加酶量(X2)、pH(X3)三個因素為自變量,采用軟件Design-Expert V8.0.6.1設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗,因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels usedin response surface experiment

1.2.5 亞鐵螯合率的測定 酶解液用2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(10 mmol/L,pH5.5)稀釋5倍后,取1.96 mL與280 μL FeCl2·4H2O溶液(0.25 mmol/L)混合于試管中,37 ℃保溫3 h后,加入560 μL菲啰嗪溶液(5 mmol/L),混勻后靜置10 min,在562 nm處測定其吸光值[13]。以蒸餾水代替酶解產(chǎn)物做總體對照,以蒸餾水代替菲啰嗪做空白對照。亞鐵螯合率(%)的計算公式為:

其中,A0為總鐵對照吸光值,A1為樣品吸光值,A2為空白對照吸光度。

1.2.6 水解度的測定 水解度可用于衡量蛋白質(zhì)的水解程度。采用茚三酮法比色法[15]測定DH。取0.1000 g干燥過的甘氨酸溶于蒸餾水后定容至100 mL,取出2.00 mL定容到100 mL,得到20 μg/mL的溶液。取此溶液稀釋成含量為2～20 μg/mL的溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取2.00 mL稀釋液于具塞刻度試管中,分別加入1.00 mL茚三酮顯色劑,混勻后置于沸水浴中加熱15 min,同時作空白試驗立即在冷水中冷卻,加入5.00 mL 40%乙醇溶液,劇烈震蕩數(shù)分鐘至棕紅色退去,室溫放置15 min,以蒸餾水調(diào)零于570 nm處測定吸光值。以甘氨酸摩爾數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將酶解液稀釋至合適倍數(shù)后,取2.00 mL稀釋液于試管中并加入1.00 mL茚三酮顯色劑,混勻后置于沸水浴中加熱15 min,同時作空白試驗,其余操作同上。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算水解蛋白液中-NH2含量(μmol/mL)。水解度的計算公式為:

式中:DH:水解度(%);h:酶解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g)-NH2;htot:每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g)。

1.2.7 氨基酸組成分析 參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[16]的方法進(jìn)行測定。分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg南極磷蝦與AKIP樣品,置于安瓿瓶中,加入10.0 mL 6 mol/L的鹽酸,封瓶。在110 ℃下水解24 h,脫酸、定容后,使用Sykam S-433D全自動氨基酸分析儀對其進(jìn)行氨基酸分析。

1.2.8 分子量的測定 分子量分布采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行測定,色譜柱采用TSK GEL G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)。稱取AKIP樣品100 mg于10 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,經(jīng)0.45 μm微孔過濾膜過濾后,取20 μL通過凝膠過濾色譜進(jìn)行分子量測定。流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸,45∶55∶0.1 (V/V),流速為0.5 mL/min,柱溫30 ℃,紫外檢測波長為220 nm。稱取細(xì)胞色素C、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。用GPC軟件處理數(shù)據(jù),得到AKIP的相對分子質(zhì)量分布和其分布范圍。

1.2.9 抗氧化能力的測定

1.2.9.1 DPPH自由基清除率測定 準(zhǔn)確吸取2.00 mL濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、20 mg/mL的AKIP樣品溶液與2.00 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mol/L)混勻,在室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測定溶液吸光值。采用谷胱甘肽(GSH)為陽性對照[17]。DPPH自由基清除率的計算公式為:

式中:A0為空白組吸光度值;A1為對照組吸光度值;A2為樣品組吸光度值。

1.2.9.2 羥自由基清除率測定 準(zhǔn)確吸取1.00 mL濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、20 mg/mL的AKIP樣品溶液于試管中,然后依次加入1.00 mL 9 mmol/L FeSO4溶液,1.00 mL 9 mmol/L水楊酸溶液,0.2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng),37 ℃恒溫水浴30 min,于510 nm處測定溶液吸光值。采用GSH為陽性對照[17]。羥自由基清除率的計算公式為:

式中:A0為空白組吸光度值;A1為對照組吸光度值;A2為樣品組吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示(n=3)。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對南極磷蝦酶解液水解度與亞鐵螯合率的影響如圖1所示。由圖1可知,5種蛋白酶的水解度隨時間延長而逐漸增大。在30～60 min內(nèi),水解度隨酶解時間的延長而迅速升高,這是由于在初始反應(yīng)階段酶切位點較多,大量肽鍵在短時間內(nèi)被切斷。在120～360 min,水解速率逐漸降低,這可能是由于蛋白酶的逐漸失活及酶解產(chǎn)物的抑制有關(guān)。在5種蛋白酶中,經(jīng)Alcalase 2.4 L和胰蛋白酶酶解的南極磷蝦酶解液中DH相對較高,在酶解360 min時水解度分別為18.27%和17.43%,與朱俊向等[18]采用動物蛋白酶酶解南極磷蝦蛋白測得的水解度基本一致。

圖1 不同蛋白酶對南極磷蝦酶解液水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree ofenzymatic hydrolysates of Antarctic krill

由圖2可知,5種蛋白酶的亞鐵螯合率隨時間延長整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中,中性蛋白酶的變化幅度較大,而經(jīng)Alcalase 2.4 L處理后的酶解液亞鐵螯合率最高,在酶解240 min時其亞鐵螯合率為64.21%。隨酶解時間的延長,酶解反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行,具有亞鐵螯合活性的多肽被酶解成單個游離氨基酸,從而導(dǎo)致亞鐵螯合率降低。綜合考慮水解度和亞鐵螯合率兩方面因素,選用Alcalase 2.4L作為酶解南極磷蝦蛋白的實驗用酶。

圖2 不同蛋白酶對南極磷蝦酶解液亞鐵螯合率的影響Fig.2 Effect of different proteases on iron-chelatingrate of enzymatic hydrolysates of Antarctic krill

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 pH對亞鐵螯合率和水解度的影響 反應(yīng)體系pH的變化會直接影響蛋白酶分子的空間構(gòu)象、酶與底物的結(jié)合狀態(tài)及酶-底物復(fù)合物的解離,進(jìn)而影響酶解反應(yīng)速率與酶解液亞鐵螯合率[19-20]。由圖3可知,在實驗所選范圍內(nèi),亞鐵螯合率和水解度隨pH的增大均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,兩者呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。這是因為Alcalase 2.4 L有其最適作用pH,當(dāng)溶液環(huán)境過酸或過堿時,均可引起酶構(gòu)象發(fā)生改變,酶活力下降[11],致使水解度發(fā)生變化,總而引起亞鐵螯合率的變化。當(dāng)pH為8時,亞鐵螯合率和螯合物得率均達(dá)到最大值,分別為78.94%和23.49%,因此選擇pH8作為最佳pH。

圖3 pH對亞鐵螯合率和水解度的影響Fig.3 Effect of pH on iron-chelating rate and DH

2.2.2 酶解溫度對亞鐵螯合率和水解度的影響 由圖4可知,溫度在35～55 ℃時,亞鐵螯合率隨溫度增加而明顯增加。亞鐵螯合率在55 ℃時,達(dá)到最大值77.58%,而水解度在45 ℃時達(dá)到最大值21.09%。當(dāng)溫度高于55 ℃時,亞鐵螯合率和水解度均呈降低趨勢。這可能是因為隨著溫度的適當(dāng)升高,酶的活力增加,反應(yīng)體系的分子運(yùn)動加快,易與亞鐵離子螯合的氨基酸殘基和位點暴露出來,因而酶解液水解度和亞鐵離子螯合率增大[21-22]。但當(dāng)溫度高于Alcalase 2.4 L的最適溫度后,酶活性降低,延緩了酶解進(jìn)程,因而水解度和亞鐵螯合率均降低。因此選擇55 ℃作為酶解溫度。

圖4 酶解溫度對亞鐵螯合率和水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on iron-chelating rate and DH

2.2.3 酶解時間對亞鐵螯合率和水解度的影響 由圖5可知,隨著酶解時間的延長,亞鐵螯合率和水解度均呈現(xiàn)增加的趨勢。當(dāng)酶解時間為240 min時,亞鐵螯合率和水解度明顯增加,當(dāng)酶解時間超過300 min時,兩者無明顯增加。酶解初期大量可溶性肽被釋放到溶液中,因此在一定時間范圍內(nèi),水解度與亞鐵螯合率呈上升趨勢。隨酶解時間的延長,底物基本酶解完全,生成大量地小分子肽,因而在300 min后,水解度與亞鐵螯合率無明顯增加。因此選擇300 min(即5 h)作為酶解時間。

圖5 酶解時間對亞鐵螯合率和水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis timeon iron-chelating rate and DH

圖6 加酶量對亞鐵螯合率和水解度的影響Fig.6 Effect of enzyme doseon iron-chelating rate and DH

2.2.4 加酶量對亞鐵螯合率和水解度的影響 由圖6可知,當(dāng)加酶量低于5%時,亞鐵螯合率和水解度隨加酶量的增大均呈上升趨勢。當(dāng)加酶量高于5%時,水解度持續(xù)增大,但亞鐵離子螯合率增長趨勢放緩。這是因為隨著加酶量的增加,酶與蛋白質(zhì)分子的接觸幾率增多,蛋白被迅速分解為小分子肽,易與亞鐵離子螯合的氨基酸殘基與位點被暴露出來[18]。過量酶分子可能會抑制中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為酶解終產(chǎn)物,從而使產(chǎn)物亞鐵螯合率無法進(jìn)一步提升?？紤]到成本問題,選擇5%為最佳加酶量。

表3 亞鐵螯合率回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation for iron-chelating rate

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 綜合單因素實驗結(jié)果,固定酶解時間5 h,選取酶解溫度、加酶量、pH 3個因素為自變量,以亞鐵螯合率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗,試驗設(shè)計方案和結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results for response surface experiment

2.3.2 交互作用分析 圖7中響應(yīng)面的變化及等高線的形狀可直觀地反映酶解溫度、加酶量和pH三個因素對南極磷蝦酶解產(chǎn)物亞鐵螯合率的影響。在響應(yīng)面圖中,曲面越陡峭,表示兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響越顯著,在等高線圖中,等高線越近似橢圓,則表示兩因素交互作用越顯著[15]。由圖7a可知,當(dāng)加酶量一定時,亞鐵螯合率隨酶解溫度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。由等高線的形狀可以看出酶解溫度和加酶量的交互作用對響應(yīng)值影響不顯著。由圖7b可知,在相同的酶解溫度下,亞鐵螯合率隨pH的增加而增加,當(dāng)pH升到一定值時,繼續(xù)增大pH,亞鐵螯合率增加卻不明顯,稍有下降。由等高線的形狀可以看出,pH和酶解溫度的交互作用對響應(yīng)值影響顯著。由圖7c可知,當(dāng)加酶量一定時,亞鐵螯合率隨pH的增大而逐漸增大,當(dāng)pH達(dá)到一定值后,螯合率增加不明顯。加酶量與pH的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著。

圖7 各因素交互作用影響亞鐵螯合率的響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on iron-chelating rate

2.3.3 最佳酶解條件的確定及驗證 通過軟件分析得到以亞鐵螯合率為指標(biāo)的最佳酶解條件為酶解溫度57.59 ℃,加酶量5.51%,pH8.79,此時的亞鐵螯合率預(yù)測值為78.88%,結(jié)合實際操作,將酶解條件調(diào)整為酶解溫度57.6 ℃,加酶量5.5%,pH為8.8,在此條件下進(jìn)行三次實驗,測得亞鐵螯合率為77.77%±0.72%,與預(yù)測值接近,其相對誤差為1.11%,DH為23.22%±0.16%。說明此酶解條件下的回歸模型方程可靠。

2.4 南極磷蝦蛋白與AKIP的氨基酸組成分析

對南極磷蝦蛋白與AKIP進(jìn)行氨基酸組成分析,其結(jié)果如表4所示。由表4可知,經(jīng)Alcalase 2.4 L酶解優(yōu)化制備的南極磷蝦酶解產(chǎn)物中,Lys、Glu、Asp、Arg等氨基酸含量較高。研究表明,蛋白肽的亞鐵螯合活性與其氨基酸的組成具有密切關(guān)系,螯合活性較好的肽中通常含有較多的Glu、Asp、Lys、His、Cys、Arg、Ser等[23]。Wu等[13]通過酶解太平洋鱈魚皮分離純化出三條亞鐵螯合肽,并證實了Lys、Asp、His及Arg是具有亞鐵離子螯合活性的氨基酸。Xia等[24]研究發(fā)現(xiàn),大麥谷蛋白多肽中的Met、Glu、Lys和Arg對亞鐵離子螯合活性貢獻(xiàn)較大。研究發(fā)現(xiàn)多肽中的鐵螯合位點主要是羰基和肽鍵[25]。Perrin D[26]認(rèn)為,Glu和Asp因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠與鐵離子形成穩(wěn)定的螯合物。此外,氨基酸的末端羧基以及Arg側(cè)鏈的氨基與亞胺基團(tuán)是多肽與亞鐵離子的螯合位點[13]。而AKIP中含有的特定氨基酸含量豐富,表明南極磷蝦酶解產(chǎn)物具有良好的亞鐵螯合活性位點。

2.5 AKIP分子量的測定

在最佳酶解條件下,采用Alcalase 2.4 L酶解南極磷蝦制備AKIP,并對其相對分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定,結(jié)果如圖8所示。

圖8 AKIP的分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of AKIP

表4 南極磷蝦蛋白與AKIP氨基酸組成分析(g/100 g)Table 4 Analysis of amino acid composition ofprotein of Antarctic krill and AKIP(g/100 g)

AKIP的分子量分布范圍如表5所示。AKIP的分子量主要集中在180～1000 Da 之間,約占89.28%;1000～2000 Da的多肽分子占8.31%;2000～3000 Da的多肽分子占1.32%;3000～5000 Da的多肽分子占0.65%;大于5000 Da的多肽分子占0.44%;表明經(jīng)Alcalase 2.4 L酶解后的AKIP是一種小分子肽。AKIP具有較強(qiáng)的亞鐵離子螯合活性。研究發(fā)現(xiàn),螯合活性與其分子量大小具有一定的相關(guān)性,低分子量肽具有相對較好的螯合活性[23]。Guo等[27]從狹鱈魚皮酶解液中分離純化出一條亞鐵螯合肽(Ser-Cys-His),其分子量僅為345 Da,亞鐵螯合活性為61.3%。鷹嘴豆中低分子量肽(<500 Da)比高分子量肽具有更好的亞鐵螯合活性[28]。Cian等[12]通過酶解紅藻蛋白制備出兩種不同分子量的多肽,并證明了分子量為270 Da的小肽較分子量為1013 Da的多肽組分具有更強(qiáng)的亞鐵螯合活性。Xia等[24]對麥谷抗氧化肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征時發(fā)現(xiàn),低分子量肽(<1 kDa)具有更強(qiáng)的亞鐵離子螯合活性。

表5 AKIP的分子量范圍Table 5 Molecular weight range of AKIP

2.6 AKIP的體外抗氧化能力

2.6.1 AKIP對DPPH自由基清除效果 氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)及AKIP序列可以顯著的影響DPPH自由基的清除能力。由圖9可知,AKIP與GSH對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)較好地劑量-效應(yīng)關(guān)系。GSH對DPPH·呈現(xiàn)較好的清除率,當(dāng)GSH濃度為1 mg/mL時,可達(dá)到94.92%。當(dāng)AKIP濃度為10 mg/mL時,清除率可達(dá)87.52%。AKIP與GSH對DPPH自由基的清除率IC50分別為1.92、0.073 mg/mL。而板栗多肽對DPPH自由基清除率IC50為3.336 mg/mL[29],表明AKIP相比板栗多肽具有更好的清除DPPH自由基能力。

圖9 AKIP對DPPH自由基清除效果Fig.9 DPPH radical scavenging capacity of AKIP

2.6.2 AKIP對羥自由基清除效果 羥自由基具有極強(qiáng)的氧化能力,可與絕大多數(shù)物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)而影響其品質(zhì),因此對羥自由基的清除效果在一定程度上可反映物質(zhì)的抗氧化能力。圖10反映了AKIP與GSH對羥自由基的清除能力,體現(xiàn)出良好地劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)GSH濃度為1 mg/mL時,羥自由基清除率高達(dá)95.6%。當(dāng)AKIP溶液為5 mg/mL時,可達(dá)到71.88%。AKIP與GSH對羥自由基的清除率IC50分別為2.09、0.027 mg/mL。而從鯔魚蛋白中制備的抗氧化肽對羥自由基清除率IC50僅為4.69 mg/mL[30]。說明在實驗所選范圍內(nèi),AKIP對羥自由基具有良好的清除能力,是潛在的抗氧化物質(zhì)。

圖10 AKIP對羥自由基清除效果Fig.10 Hydroxyl radical scavenging capacity of AKIP

3 結(jié)論

本試驗先采用5種蛋白酶對南極磷蝦蛋白進(jìn)行酶解,篩選出酶解最佳用酶為Alcalase 2.4 L。在單因素實驗基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化出南極磷蝦蛋白最佳酶解工藝為:酶解溫度為57.6 ℃,加酶量5.5%,pH8.8,酶解時間5 h,此時的亞鐵螯合率為77.77%±0.72%,水解度為23.22%±0.16%。氨基酸組成分析表明,AKIP具有良好的亞鐵螯合活性位點。相對分子質(zhì)量主要集中在180～1000 Da,約占89.28%。此外,抗氧化實驗結(jié)果表明,AKIP對DPPH自由基、羥自由基的清除率IC50分別為0.073、0.027 mg/mL,表明AKIP具有良好的清除DPPH自由基和羥自由基能力,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,為進(jìn)一步開發(fā)南極磷蝦肽高值化相關(guān)產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。