,*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450002;2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002;3.河南省冷鏈食品質(zhì)量安全控制重點實驗室,河南鄭州 450002)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國特有的經(jīng)濟樹種和名貴中藥材,具有調(diào)血壓、降血糖、抗菌、調(diào)血脂、抗病毒、抑制腫瘤細胞生長等功能,能夠延緩衰老、滋陰補腎、美容養(yǎng)顏和強壯筋骨[1]。研究表明,杜仲葉含有豐富的營養(yǎng)成分,其中綠原酸、桃葉珊瑚苷等主要活性物質(zhì)含量是皮中含量的數(shù)倍。并且,在降血壓、抗衰老、補肝腎、助減肥等方面,杜仲葉的功效比杜仲皮更優(yōu)[2]。

杜仲茶是以杜仲葉為原料,經(jīng)傳統(tǒng)的茶葉生產(chǎn)工藝制作而成的健康飲品。目前,杜仲茶的研究主要集中在工藝優(yōu)化、品質(zhì)分析、功能性分析等方面,王太霞等[3]研究了不同加工工藝所生產(chǎn)的杜仲茶的化學(xué)成分,探索出提高活性成分含量的最優(yōu)工藝。Dong等[4]研究了微波干燥對杜仲雄花茶功能性成分的影響,發(fā)現(xiàn)通過微波干燥技術(shù)制成的杜仲雄花茶茶湯橙黃明亮,滋味醇厚。周繼榮等[5]比較了炒青、蒸青、燙青和微波殺青4種殺青技術(shù)對杜仲綠茶品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)微波殺青效果較好。黃友誼等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)杜仲茶含有豐富的營養(yǎng)成分和功能活性成分,并具有顯著保健功能。劉夢培等[7]研究了發(fā)酵對杜仲茶活性成分及抗氧化性能的影響,結(jié)果表明發(fā)酵可以提高杜仲葉茶的品質(zhì)性能。相關(guān)研究表明,采用混合型高脂血癥動物模型研究杜仲茶的輔助降血脂功能,發(fā)現(xiàn)杜仲茶輔助降血脂功能顯著[8]。

冠突散囊菌是茯磚茶中有益微生物,又被稱作金花菌,“金花”的數(shù)量和質(zhì)量往往直接決定了茯磚茶的品質(zhì)[9]。其代謝產(chǎn)物能有效地調(diào)節(jié)人體新陳代謝,并有較強的降脂、降壓、調(diào)節(jié)糖類代謝的功效,對人體無毒無害[10]。肖文軍等[11]研究了速溶茯茶對雌雄大鼠的毒理特性,結(jié)果表明茯茶對雌雄大鼠無明顯毒副作用,屬實際無毒物。王志剛[12]用鹵蟲生物法對冠突散囊菌進行毒性實驗,在蔗糖酵母浸汁培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果10株冠突散囊菌菌體提取物均未發(fā)現(xiàn)明顯產(chǎn)毒,從而進一步證實了冠突散囊菌無毒。近年來,關(guān)于冠突散囊菌發(fā)酵茶的研究很多,主要在冠突散囊菌的發(fā)酵條件,發(fā)酵作用等方面。歐陽梅[13]選用炒青綠茶作為茶坯,人工接種冠突散囊菌,制成一種新型的黑散茶。Chenkai等[14]選用冠突散囊菌發(fā)酵普洱茶,研究發(fā)酵作用對茶葉化學(xué)成分及降脂作用的影響,結(jié)果表明經(jīng)發(fā)酵后的茶葉的茶多酚和氨基酸含量顯著降低,而黃酮類總量顯著增加,且降脂作用顯著增強。秦俊哲等[15]利用冠突散囊菌發(fā)酵劑制作茯磚茶,發(fā)現(xiàn)茶多糖、水浸出物和茶褐素含量上升,感官評定結(jié)果顯示“發(fā)花”對茯磚茶的品質(zhì)形成有促進作用。Yao等[16]研究分析了不同發(fā)酵溫度下茯磚茶的沒食子酸含量和抗氧化性能,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)提高發(fā)酵溫度使發(fā)酵后的茶葉沒食子酸含量和抗氧化特性顯著升高。

目前,杜仲茶的制作工藝大多采用傳統(tǒng)制茶工藝,加工方法較為單一,口感多有青草的澀味;而采用人工接種冠突散囊菌發(fā)酵工藝制作杜仲茶的研究未見報道,本文擬通過接種冠突散囊菌于杜仲綠毛茶上,制成冠突散囊菌發(fā)酵茶,并對發(fā)酵關(guān)鍵工藝進行優(yōu)化,得到富含活性成分的杜仲茶,為以后的應(yīng)用提供一定的實踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 在河南泡桐中心院內(nèi)進行的采摘,進行實驗的葉子是經(jīng)過挑選的無斑點,無枯萎狀的杜仲葉;冠突散囊菌(Eurotiumcristatum2650) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;PDA瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;綠原酸對照品 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、甲醇 天津市富宇精細化工有限公司。

JJ223BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;MB23紅外水分測定儀 奧豪斯儀器(常州)有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;HZQ-F160型全溫震蕩培養(yǎng)箱 江蘇太倉試驗實驗設(shè)備廠;M1-L201B微波爐 廣東美的廚房電器制造有限公司;101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS型恒溫恒濕箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DNP-9052A培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司;KQ-700DE型超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冠突散囊菌孢子懸液的制備 將在PDA培養(yǎng)基中保存的菌種在28 ℃下培養(yǎng)4 d,用接種環(huán)挑取菌落溶于有10 mL無菌水且?guī)в胁Ａе榈娜瞧績?nèi),于28 ℃,150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min,制得均勻的孢子懸液,濃度為(1～10)×103cfu/mL。

1.2.2 發(fā)酵茶的工藝流程[17-18]原料選擇→一次汽蒸→渥堆→調(diào)節(jié)含水量→二次汽蒸→接種→培養(yǎng)發(fā)花→干燥→成品

工藝要點:一次汽蒸:將挑選好的茶葉在立式壓力蒸汽滅菌鍋中121 ℃下汽蒸10 min;渥堆:將濕熱狀態(tài)下的茶葉在特定溫濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行渥堆;調(diào)節(jié)含水量:向渥堆后的茶葉加蒸餾水以調(diào)節(jié)水分含量,用紅外水分測定儀測定水分含量;二次汽蒸:將調(diào)節(jié)好水分含量的茶葉以10 g分裝,用立式壓力蒸汽滅菌鍋在121 ℃下汽蒸20 min;接種:在無菌操作臺上將滅菌后的茶樣冷卻后,接種冠突散囊菌孢子懸浮液;培養(yǎng)發(fā)花:將接種后的茶葉置于28 ℃,75%濕度的恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發(fā)酵天數(shù)對茶葉的影響 將10 g綠毛茶經(jīng)過一次汽蒸10 min后,50 ℃渥堆2 h,含水量控制為35%,攪拌均勻后封口,滅菌后進行無菌接種,菌種的接種量是原料重量的20%,在28 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵天數(shù)分別設(shè)定在6、7、8、9、10 d,對茶葉的發(fā)花情況以及冠突散囊菌孢子數(shù)量進行檢測,并對茶葉中綠原酸的含量進行測定。

1.2.3.2 含水量對茶葉的影響 將10 g綠毛茶經(jīng)過一次汽蒸10 min后,50 ℃渥堆2 h,將含水量分別調(diào)至25%、30%、35%、40%、45%。攪拌均勻后封口,滅菌后進行無菌接種,菌種的接種量是原料重量的20%,在28 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵7 d后對茶葉的發(fā)花情況以及冠突散囊菌孢子數(shù)量進行檢測,并對茶葉中綠原酸的含量進行測定。

1.2.3.3 接種量對茶葉的影響 將10 g綠毛茶經(jīng)過一次汽蒸10 min后,50 ℃渥堆2 h,將含水量控制為35%,攪拌均勻后封口,滅菌后進行無菌接種,菌種的接種量是分別為原料重量的17%、18%、19%、20%、21%。在28 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵天數(shù)7 d后對茶葉的發(fā)花情況以及冠突散囊菌孢子數(shù)量進行檢測,并對茶葉中綠原酸的含量進行測定。

1.2.3.4 渥堆溫度對茶葉的影響 將10 g綠毛茶經(jīng)過一次汽蒸10 min后,分別在30、35、40、45、50 ℃渥堆2 h,將含水量控制為35%,攪拌均勻后封口,滅菌后進行無菌接種,菌種的接種量是原料重量的20%。在28 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵天數(shù)7 d后對茶葉的發(fā)花情況以及冠突散囊菌孢子數(shù)量進行檢測,并對茶葉中綠原酸的含量進行測定。

1.2.3.5 渥堆時間對茶葉的影響 將10 g綠毛茶經(jīng)過一次汽蒸10 min后,50 ℃下分別渥堆1、2、3、4 h后,將含水量控制在35%,攪拌均勻后封口,滅菌后進行無菌接種,菌種的接種量是原料重量的20%。在28 ℃條件下發(fā)酵。發(fā)酵天數(shù)7 d后對茶葉的發(fā)花情況以及冠突散囊菌孢子數(shù)量進行檢測,并對茶葉中綠原酸的含量進行測定。

表2 發(fā)酵天數(shù)對茶葉孢子數(shù)和綠原酸含量的影響Table 2 Effect of Fermentation Days on the Number of Spores and Chlorogenic Acid Content of the tea

注:同一列不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。1.2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上,選用對發(fā)花影響因素較大的4個因素(接種量、含水量、渥堆時間和渥堆溫度),以冠突散囊菌孢子數(shù)以及綠原酸含量為指標,對發(fā)花工藝參數(shù)進行優(yōu)化。由于2個指標對冠突散囊菌發(fā)酵茶葉品質(zhì)的貢獻不一樣,采用多指標加權(quán)綜合評分法進行分析[19]。因此,將孢子數(shù)、綠原酸含量的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為0.6、0.4,最高100分,最低0分,綜合評分=(孢子數(shù))×0.6+(綠原酸含量)×0.4,以綜合評分進行統(tǒng)計分析。因素水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 L9(34)Factor level table of orthogonal test

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 孢子數(shù)的檢測 發(fā)酵結(jié)束后,按照GB/T 9833.3-2013《茶取樣》[20]的規(guī)定取樣。每組每個接種量取1個樣品,每個樣品取1.00 g茶葉浸于裝有玻璃珠的100 mL滅菌蒸餾水中,在恒溫振蕩器中150 r/min振搖45 min混勻,使冠突散囊菌的孢子能夠均勻的擴散,對冠突散囊菌進行計數(shù)[21]。

1.2.5.2 綠原酸含量的測定[22]對照品溶液的制備:精密稱取綠原酸對照品2.5 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加入70%甲醇溶液定容至刻度,制成濃度為25 μg/mL的綠原酸對照品溶液。

樣品溶液的制備:精密稱取樣品0.1000 g于10 mL離心管,加入3 mL 70%甲醇提取,在超聲功率70%下超聲30 min,取出上清液,殘渣再用3 mL 70%甲醇提取,合并兩次提取液,在7000 r/min下離心15 min,取出上清液,用70%甲醇定容到50 mL容量瓶中。

標準曲線的繪制:精密吸取綠原酸對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分別置于10 mL離心管中,加70%甲醇定容到刻度,配成不同質(zhì)量濃度的綠原酸標準品溶液,用紫外分光光度計選取綠原酸最大吸收波長327 nm下測其吸光度,70%的甲醇溶液為空白對照,以吸光度為縱坐標,綠原酸標準液濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

樣品液含量的測定:吸取樣品溶液0.5 mL置于10 mL離心管中,用70%甲醇定容,70%甲醇為空白對照,于327 nm下測量吸光度,計算綠原酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個試驗測定3次,測定結(jié)果以平均值±標準差表示。采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵天數(shù)對茶葉冠突散囊菌孢子數(shù)及綠原酸含量的影響

冠突散囊菌的生長受發(fā)酵天數(shù)的影響,由表2可知,隨著發(fā)酵天數(shù)的增長,冠突散囊菌孢子數(shù)呈增加趨勢,且發(fā)花情況逐漸變好。但8 d后,孢子數(shù)增長速率降低并趨于平緩,之后進入生長平緩期,說明此時冠突散囊菌的有性繁殖能力降低,生化等活動能力下降。

由表2可知,發(fā)酵第6 d時綠原酸含量最高,第8天次之,呈降低趨勢。可能是因為冠突散囊菌在生長旺盛時分泌多酚氧化酶,而綠原酸是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinicacid)生成的縮酚酸,與兒茶素等酚酸類物質(zhì)有相似的官能團,所以導(dǎo)致綠原酸含量的減少[23]。隨著發(fā)酵時間的增長,氧氣逐漸減少,又減緩了氧化反應(yīng)的發(fā)生,所以綠原酸含量出現(xiàn)浮動。綜合考慮,且為了減少發(fā)酵的時間成本,故選擇8 d發(fā)酵結(jié)束。

2.2 含水量對茶葉冠突散囊菌孢子數(shù)及綠原酸含量的影響

含水量是微生物生長繁殖和進行代謝活動的重要媒介,也是冠突散囊菌生長繁殖所必需的條件[24]。由表3可知,當(dāng)含水量低于35%時,冠突散囊菌生長情況較差,顆粒不夠飽滿,顏色較淺,孢子數(shù)量較少,說明含水量過少,不利于冠突散囊菌的生長繁殖。當(dāng)含水量高于45%時,冠突散囊菌生長茂盛,分布均勻,但滋生雜菌,且孢子數(shù)減少。

表3 含水量對茶葉孢子數(shù)和綠原酸含量的影響Table 3 Effect of water content on the number of spores and the content of chlorogenic acid of the tea

注:同一列不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表4 接種量對茶葉孢子數(shù)和綠原酸含量的影響Table 4 Effect of inoculum quantity on the number of spores and chlorogenic acid content of the tea

注:同一列不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表5 渥堆溫度對茶葉孢子數(shù)和綠原酸含量的影響Table 5 Effect of stacking temperature on the number of spores and chlorogenic acid content of the tea

注:同一列不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

含水量對綠原酸含量的影響顯著,含水量為25%時,綠原酸含量最高,且隨著含水量的增加,綠原酸含量呈降低趨勢,含水量45%時,綠原酸含量最低。可能由于隨著含水量的升高,冠突散囊菌大量繁殖,分泌多酚氧化酶,大量消耗底物,導(dǎo)致綠原酸含量的降低[25]。

2.3 接種量對茶葉冠突散囊菌孢子數(shù)量及綠原酸含量的影響

接種量是影響冠突散囊菌發(fā)花情況的一個重要指標,接種量的多少直接影響到發(fā)花的好壞。接種量越多,越易形成優(yōu)勢菌種,生成特有的成分。但由于底物是有限的,若接種量過大,則會影響微生物的生長繁殖。由表4可知,隨著接種量的增加,孢子數(shù)呈增加的趨勢,且發(fā)花情況越來越好,當(dāng)接種量為20%時,冠突散囊菌生長情況較好,金花顆粒飽滿,顏色金黃,分布均勻,且孢子數(shù)較多。而當(dāng)接種量為21%時,冠突散囊菌孢子數(shù)的增加量是減少的,說明此時微生物對茶葉底物的利用已經(jīng)達到飽和,微生物自身的生長繁殖也受到限制。

茶葉中多酚類物質(zhì)在氧氣和多酚氧化酶的作用下氧化成鄰醌類,可能是由于在發(fā)花過程中,由于環(huán)境的封閉,導(dǎo)致氧氣逐漸減少,從而減緩氧化反應(yīng)的發(fā)生,減少綠原酸含量的降解[26]。所以隨著接種量的增加,綠原酸含量有些許增加。

2.4 渥堆溫度對茶葉冠突散囊菌孢子數(shù)及綠原酸含量的影響

渥堆的溫度不僅影響茶葉中微生物的生長代謝速率與酶的活性,還影響著茶葉微生物的種群與數(shù)量,從而導(dǎo)致茶葉內(nèi)含成分的差別。由表5可知,當(dāng)?shù)陀?5 ℃時,冠突散囊菌的數(shù)量隨著渥堆溫度的增加而增加,且發(fā)花情況越來越好,可能是當(dāng)渥堆溫度較高時,能夠使葉片更好地保持濕熱作用,且促進微生物的新陳代謝[27];當(dāng)溫度高于45 ℃時,孢子數(shù)數(shù)量是增加的,但增長速率降低,說明此時已不能為微生物的生長提供較好的環(huán)境。

由表5可知,隨著渥堆溫度的升高,綠原酸含量逐漸升高。可能是因為較高的渥堆溫度抑制了茶葉中多酚氧化酶的活性,減少了茶葉內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[28],但在發(fā)花期間,冠突散囊菌也會分泌多酚氧化酶,會使綠原酸的含量有所降低。綜合兩種作用之后對于綠原酸含量的升高,其機理有待進一步研究。

2.5 渥堆時間對茶葉冠突散囊菌孢子數(shù)及綠原酸含量的影響

渥堆時間的長短是影響茶葉的物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要影響因素。

表6 渥堆時間對茶葉孢子數(shù)和綠原酸含量的影響Table 6 Effect of stacking time on the number of spores and chlorogenic acid content of the tea

注:同一列不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表7 L9(34)正交試驗設(shè)計編碼及結(jié)果Table 7 L9(34)The design coding and results of orthogonal test

渥堆時間短,高分子物質(zhì)成分降解不充分,則冠突散囊菌生成量少,茶葉的菌香味淡,成色成味物質(zhì)欠缺;渥堆時間過長;茶葉中的高分子物質(zhì)成分降解過度,則霉菌等大量繁殖,導(dǎo)致茶葉菌香味減少,酸、霉等異味增加[29];由表6可知,隨著渥堆時間的增長,孢子數(shù)呈先上升后下降的趨勢。2 h時孢子數(shù)達到最大,且冠突散囊菌生長茂盛,分布均勻,顆粒金黃飽滿?？赡苁怯捎跉⑶?、一次汽蒸之后,茶葉本身的多酚氧化酶活性被鈍化[30],所以,綠原酸的降解變少,雖在發(fā)花期間孢子數(shù)增多,分泌的多酚氧化酶增多,綠原酸開始降解,但綜合兩種作用,綠原酸含量呈現(xiàn)升高的趨勢;隨著渥堆時間的延長,由于茶葉自身的濕熱作用,多酚氧化酶活性逐漸升高,綠原酸逐漸降解,在發(fā)花期間,即使冠突散囊菌孢子數(shù)逐漸降低,分泌的胞外酶隨之減少,但可能由于渥堆后期對綠原酸的降解作用,使之最后表現(xiàn)為降低的趨勢。關(guān)于渥堆過程中綠原酸含量的變化及其原因,有待進一步研究。

2.6 正交試驗結(jié)果

對優(yōu)化結(jié)果采用直觀分析法和方差分析,從表7的極差值大小可以得出,影響因素的主次順序為接種量>渥堆時間>渥堆溫度>含水量。由表8方差分析結(jié)果可知,接種量、渥堆時間對茶葉的品質(zhì)影響顯著(P<0.05),含水量、渥堆溫度對茶葉的品質(zhì)無顯著影響(P>0.05)。說明接種量對茶葉品質(zhì)影響最大,含水量最小。各因素的最優(yōu)水平組合為A2B1C3D2,即接種量為20%、含水量為35%、渥堆時間為3 h和渥堆溫度為45 ℃。

表8 正交試驗結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal test results

2.7 驗證試驗

在最佳組合A2B1C3D2條件下進行3次試驗求取平均值,孢子數(shù)為1.13×106CFU/g干茶,綠原酸含量為0.478 mg/g,且金花茂盛,顆粒飽滿,有濃郁的香氣。

3 結(jié)論

通過單因素及正交試驗確定了杜仲葉發(fā)酵茶葉的加工工藝,得到最佳的發(fā)花工藝條件為:即接種量20%,含水量35%,渥堆時間3 h和渥堆溫度45 ℃,在此條件下,發(fā)酵茶葉孢子數(shù)為1.13×106CFU/g干茶,綠原酸含量為0.478 mg/g,且金花茂盛,顆粒飽滿,有金花香氣,氣味濃郁。