劉瑞娜,周 雪,梁 玉,賀 菁,趙鵬昊,趙 桉,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

雙歧桿菌是人類腸道最早定殖的微生物之一,能夠維持宿主腸道的微生態(tài)平衡,具有合成多種維生素、促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)能等重要生理功能,在保持機(jī)體健康方面起重要作用[1-2]。出生一周的嬰兒腸道中雙歧桿菌含量可達(dá)腸道菌群的90%以上[3-4],成人腸道中雙歧桿菌含量只占腸道菌群的3%～10%,普遍低于嬰兒。雙歧桿菌在嬰兒腸道和成人腸道中不僅存在數(shù)量上的差異,而且菌種組成差異也較大。嬰兒腸道中以B.breve,B.longumsubsp.longum,B.longumsubsp.infantis和B.bifidum為主[5],而成人腸道中則以B.adolescentis,B.catenulatum,B.pseudocatenulatum和B.longumsubsp.longum為主[6]。其中長雙歧桿菌在各個年齡段人群中都存在[7]。

雙歧桿菌基因的種間相似度極高,可達(dá)87.7%～99.5%,因此,對雙歧桿菌的分型鑒定提出了更高要求。多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)技術(shù)是1998年Maiden等提出,近年來發(fā)展較快的一種分子分型方法[8]。一般選擇6～8個編碼蛋白的管家基因進(jìn)行測序,將每一組不同的等位基因的排列組合作為一個基因型構(gòu)成等位基因圖譜(Alleles profile),分析等位基因圖譜同時進(jìn)行聚類分析,根據(jù)位點(diǎn)序列的不同賦予不同菌株序列類型(sequence typing,ST),達(dá)到對菌株進(jìn)行多位點(diǎn)精確區(qū)分[9]。Marco等[10]比較了雙歧桿菌常見種的模式菌株的7個管家基因(clpC、dnaB、dnaG、dnaJ1、purF、rpoC和xfp)串聯(lián)建立的系統(tǒng)發(fā)育樹,比單基因建樹結(jié)果更全面、合理,表明基于7個保守的管家基因的MLST技術(shù)較傳統(tǒng)的基于16S rDNA序列的分子分型方法,對于Bifidobacterium有著相對更高的分辨能力。Alexis等[11]對包括長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、動物雙歧桿菌及短雙歧桿菌的119株Bifidobacterium進(jìn)行clpC、purF等7個管家基因的MLST分析,共獲得104個ST型,在長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌間區(qū)分度達(dá)到了99%,具有精確菌株分型的能力。Yanokura等[12]通過擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified-fragment length polymorphism,AFLP)和多位點(diǎn)序列分型技術(shù)將25株長雙歧桿菌精確鑒定到亞種,同時發(fā)現(xiàn)并報道了一個長雙歧桿菌新亞種。

近幾年,國內(nèi)對成人糞便中長雙歧桿菌長亞種的多位點(diǎn)序列分型分析尚有空白。本研究以健康成人糞便為研究對象,采用純培養(yǎng)技術(shù)分離其中的長雙歧桿菌長亞種,進(jìn)一步利用16S rDNA、hsp60和MLST技術(shù)分析分離得到的長雙歧桿菌長亞種的基因多態(tài)性,為深入研究長雙歧桿菌長亞種在機(jī)體健康中的作用和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長雙歧桿菌長亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 15707 購自中國微生物菌種保藏中心(CGMCC);L-半胱氨酸鹽酸鹽 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;引物 吉林省庫美生物科技有限公司;TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker、dNTPs 天根生化科技有限公司;Taq DNA聚合酶 北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司;瓊脂糖 Sigma公司;改良MRS培養(yǎng)基:檸檬酸氫二胺2.0 g、胰蛋白胨10.0 g、乙酸鈉5.0 g、Tween-80 1.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、硫酸鎂0.58 g、三水磷酸氫二鉀2.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、蒸餾水1 L、pH=7.2;預(yù)還原液:L-半胱氨酸鹽酸鹽 3.0 g、大豆蛋白胨2.0 g、蒸餾水1 L、pH=7.2;糞便稀釋液:KH2PO44.5 g、Na2HPO46.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、吐溫-80 0.5 g、蒸餾水1 L、pH=7.2。

BCN1360型生物潔凈工作臺 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;光學(xué)顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;LJQ-F2厭氧培養(yǎng)罐 自行設(shè)計;SPX-150B型生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;微量臺式離心機(jī) 美國Beckman公司;9700 PCR擴(kuò)增儀 美國Applied biosystem公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糞便采集與菌株的分離純化

1.2.1.1 糞便采集 參考張秋雪等[13]的方法采集健康成人的糞便樣品,采集對象在采集樣品前兩周均未服用過抗生素類藥物,未使用益生菌制品且無胃腸病史。取新鮮糞便樣品立刻放入加有預(yù)還原液[14]的無菌取樣管中,封好放入冰盒內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙歧桿菌菌株的分離。

1.2.1.2 菌株的分離純化 將糞便樣品用稀釋液[15]10倍梯度稀釋,在10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度下分別取100 μL涂布于mMRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h后,選取光滑、凸起、邊緣水潤的白色或乳白色菌落鏡檢。將呈V、Y或兩端鈍圓的桿狀形態(tài)菌落劃線于mMRS培養(yǎng)基中,分別在有氧條件和嚴(yán)格厭氧條件(菌落劃線平板置于自制可密封厭氧罐中,真空泵抽真空后充入由80%氮?dú)狻?0%氫氣和10%二氧化碳組成的混合氣體,重復(fù)操作兩次)下37 ℃培養(yǎng)72 h,剔除需氧和兼性厭氧菌。選取僅在厭氧條件生長且革蘭氏染色為陽性的菌落,重復(fù)劃線純化,直至獲得鏡檢為純菌株為止。

1.2.2 生理生化試驗(yàn) 將1.2.1.2中獲得的分離株分別進(jìn)行甲基紅試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及運(yùn)動性試驗(yàn)[16-17]。

1.2.3 分離菌株基因同源性分析 選擇甲基紅試驗(yàn)陽性,過氧化氫酶、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化、吲哚和硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果均為陰性,且無運(yùn)動性的分離菌株進(jìn)行基因同源性分析。

1.2.3.1 基因組DNA的提取 按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書的步驟提取分離菌株基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 分離菌株16S rDNA序列同源性分析 16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)為:DNA模板1.0 μL;上游引物(10 μmol/L)2.0 μL;下游引物(10 μmol/L)2.0 μL;Taq DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL;10×Taq DNA polymerase Buffer(Mg2+plus)2.5 μL;dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL;ddH2O 38 μL。其中上下游引物序列27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[13]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。

1.2.3.3 分離菌株hsp60同源性分析 hsp60基因擴(kuò)增反應(yīng)體系同16S rDNA基因擴(kuò)增體系。其中上游引物為hspF3(5′-CTGGTGAAGGAGGTCGCCAA-3′),下游引物為hspR4(5′-CCATATCCTGCAGCAT AGCCTT-3′)[18]。

表1 長雙歧桿菌長亞種MLST擴(kuò)增引物Table 1 The MLST primers for Bifidobacterium longum subsp. longum

hsp60基因PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;第一階段包括94 ℃變性60 s,62 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,4個循環(huán);第二階段包括94 ℃變性60 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,21個循環(huán);第三個階段包括94 ℃變性60 s,58 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,15個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。

1.2.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析 PCR反應(yīng)完畢之后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳后,將凝膠置于紫外燈下觀察。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物獲得約1500 bp左右的條帶,hsp60擴(kuò)增產(chǎn)物獲得約650 bp左右的條帶,且條帶清晰無雜帶后,將擴(kuò)增產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3.5 分離株多位點(diǎn)序列分型分析 看家基因擴(kuò)增體系與16S rDNA基因擴(kuò)增體系相同。其中每個看家基因所用上下游引物信息如表1所示[11]。

看家基因擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃或60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。其中看家基因clpC、fusA、gyrB、purF、rplB退火溫度為60 ℃,ileS和rpoB退火溫度為55 ℃[11]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢之后,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。將電泳后的凝膠置于紫外燈下觀察。若七個看家基因條帶均單一清晰無雜帶,送PCR產(chǎn)物測序。

為提高多位點(diǎn)序列分型的準(zhǔn)確性,將看家基因進(jìn)行雙向測序,去除測序起始端與引物結(jié)合不穩(wěn)定的序列[19]。經(jīng)測序及數(shù)據(jù)處理后,最終用于MLST分析的7個看家基因序列長度分別為:clpC:603 bp、fusA:666 bp、gyrB:627 bp、ileS:489 bp、purF:591 bp、rplB:357 bp、rpoB:501 bp[11]。

將測序所獲得的序列運(yùn)用MEGA 6.0軟件,采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行同源性分析,自展值(bootstrap value)分析設(shè)置重復(fù)取樣1000次,并對分離菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 分離菌株的菌落菌體形態(tài) 從12個健康成人糞便中分離得到24株雙歧桿菌疑似菌株。菌落白色或乳白色,半透明或不透明,光滑,凸圓,邊緣整齊。24株分離株革蘭氏染色均為陽性,顯微鏡下菌體排列不規(guī)則,菌體形態(tài)呈V形、Y形、啞鈴形或兩端大小不一等形態(tài)(圖略)。

2.1.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果 24株分離株均為專性厭氧菌,甲基紅試驗(yàn)陽性,過氧化氫酶、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化、吲哚和硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果均為陰性,且均無運(yùn)動性。

2.2 分離菌株基因同源性分析

2.2.1 16S rDNA同源性分析 24株分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在1500 bp左右處有明亮單一條帶(圖1),滿足測序要求,將樣品進(jìn)行測序。將得到的測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中進(jìn)行BLAST比對,尋找數(shù)據(jù)庫中與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種,確定目的基因的歸屬。比對結(jié)果顯示:其中14株分離菌株與長雙歧桿菌的同源性均達(dá)到99%,有3株分離株與假小鏈雙歧桿菌同源性達(dá)到99%,其余7株分離株與兩歧雙歧桿菌同源性達(dá)到99%。

圖1 分離菌株16S rDNA PCR電泳圖譜Fig.1 Electrophotogram of the 16S rDNAPCR products of the isolates注:圖譜中泳道1～25從左到右依次為:2000 bp DNA Ladder Marker、菌株H1、G3、Z4、Y2-1、Y2-2、Y3、Y8、S1、S5、S6-3、S7、M4、M5、M8、W1、W2、W3、W8、T4、T6、B1、B4、T3-1、T9-1。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建長雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bifidobacterium longum based on 16S rDNA gene sequences

選取16S rDNA基因同源性99%以上的雙歧桿菌模式菌株序列,運(yùn)用MEGA6軟件對分離得到的24株分離菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示其中14株分離菌株(G3、H1、S1、S7、M4、M5、W1、W3、W8、Z4、T4、T6、Y2-1、Y2-2)均與長雙歧桿菌長亞種ATCC15707親緣關(guān)系最近,初步判定為長雙歧桿菌。

2.2.2 hsp60同源性分析 上述14株長雙歧桿菌的hsp60基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳,在650 bp左右處均有明亮單一條帶(圖3),滿足測序要求,將樣品進(jìn)行測序。

圖3 長雙歧桿菌hsp60基因的PCR電泳圖譜Fig.3 Electrophotogram of the hsp60 genePCR products of the Bifidobacterium longum strains注:圖譜中泳道1～15從左到右依次為:2000 bp DNA Ladder Marker、菌株H1、G3、Z4、Y2-1、Y2-2、S1、S7、M4、M5、W1、W3、W8、T4、T6。

將測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對,與數(shù)據(jù)庫中已知菌株的hsp60基因序列進(jìn)行對比。選取hsp60基因同源性99%以上的雙歧桿菌模式菌株序列,運(yùn)用MEGA 6.0軟件對14株分離菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

基于hsp60基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中,14株分離菌株均與Bifidobacteriumlongumsubsp. longum JCM1217親緣關(guān)系最近,結(jié)合16S rDNA結(jié)果判斷14株分離菌株均為長雙歧桿菌長亞種。其中M4、M5及W3與其余10株分離菌株有更遠(yuǎn)的進(jìn)化距離。其余的10株分離株中,Y2-1與Y2-2,S1、T4、W1及Z4親緣關(guān)系更近。

2.3 長雙歧桿菌長亞種MLST分析

2.3.1 看家基因電泳及測序結(jié)果 選取7個看家基因進(jìn)行長雙歧桿菌長亞種的MLST分析,根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法設(shè)計引物并對看家基因進(jìn)行擴(kuò)增。14株長雙歧桿菌長亞種的7個看家基因PCR擴(kuò)增后電泳,在相應(yīng)位置均有明亮單一條帶(圖5),為提高M(jìn)LST的準(zhǔn)確性,將看家基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

2.3.2 長雙歧桿菌長亞種的看家基因分型 以B.longumsubsp.longumATCC 15707為參考菌株,通過7個看家基因?qū)?4株長雙歧桿菌長亞種進(jìn)行MLST分型分析。在7個看家基因的等位點(diǎn)上,賦予每個不同的序列以不同的編號,每一組不同的看家基因編號的排列組合構(gòu)成該菌株的等位基因圖譜,將其作為一個基因型,從而每個獨(dú)特的基因型對應(yīng)了一個序列型(ST)[20]。14株長雙歧桿菌長亞種分離株共分為10個ST型,且均與B.longumsubsp.longumATCC 15707為不同的ST型(表2)。

圖4 基于hsp60基因序列構(gòu)的建長雙歧桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bifidobacterium longum based on hsp60 gene sequences

表2 14株長雙歧桿菌長亞種等位基因圖譜Table 2 Alleles profiles of 14 Bifidobacterium longum subsp. longum strains

2.3.3 長雙歧桿菌長亞種等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 分別將14株菌的7個看家基因序列按照clpC-fusA-gyrB-ileS-purF-rplB-rpoB順序連接起來,對分離株構(gòu)建聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖6)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出:分離所得14株長雙歧桿菌長亞種菌株中,分離自Y個體的菌株Y2-1和Y2-2為同一ST型,分離自S個體的菌株S1和S7為同一ST型,分離自M個體的菌株M4與M5為相同ST型,分離自T個體的菌株T4及T6為相同ST型,但分離自同一W個體的W1、W3、W8為三種不同ST型。

3 討論

本研究在對分離菌株進(jìn)行分子鑒定的過程中發(fā)現(xiàn),16S rDNA基因同源性分析結(jié)果與hsp60基因同源性分析結(jié)果一致,但hsp60基因同源性分析進(jìn)一步展示出了分離菌株間的進(jìn)化距離,而且顯示出了更高的分辨率。從圖4可以看出,菌株M4、M5和W3與其他分離株及B.longumsubsp.longumJCM1217之間進(jìn)化距離上有差異,三株分離株之間進(jìn)化距離無差異。菌株Y2-1和Y2-2以及菌株S1、T4、W1和Z4雖然在長雙歧桿菌長亞種聚類中,但存在進(jìn)化距離的差異,其中菌株Y2-1和Y2-2之間進(jìn)化距離無差異,菌株Z4和S1、T4、W1之間有進(jìn)化距離的差異。這一結(jié)果說明hsp60基因同源性分析優(yōu)于16S rDNA序列分析[13]。已有文獻(xiàn)表明hsp60基因結(jié)構(gòu)具有高度保守性,在雙歧桿菌中分布廣泛,是適用于雙歧桿菌在種或亞種水平上進(jìn)行鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析的準(zhǔn)確、便捷的首選基因[21]。

圖5 長雙歧桿菌長亞種菌株MLST等位基因PCR電泳條帶圖Fig.5 PCR electrophoresis bands of the MLST alleles of Bifidobacterium longum subsp. longum strains注:其中 a～n分別代表分離菌株G3、H1、M4、M5、S1、S7、T4、T6、W1、W3、W8、Y2-1、Y2-2、Z4。每個圖譜中泳道M～7從左到右依次為:2000 bp DNA Ladder Marker、clpC、fusA、gyrB、ileS、purF、rplB、rpoB。

圖6 長雙歧桿菌長亞種菌株等位基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of allelic genes ofBifidobacterium longum subsp. longum strains

長雙歧桿菌長亞種菌株MLST分析發(fā)現(xiàn),分離株7個看家基因等位基因數(shù)在4～9之間,gyrB基因包含最多的9個等位基因,clpC和purF基因都含有4個最少的等位基因?？醇一虻牡任换驍?shù)量反映該基因的遺傳多樣性[22],表明7個看家基因中clpC和purF基因較穩(wěn)定,基因多樣性變化最小。來源于不同個體(Z、H、G)的3株長雙歧桿菌長亞種形成了3個ST型,來源于同一個體Y(Y2-1、Y2-2)、S(S1、S7)、M(M4、M5)、T(T4、T6)的8株B.longumsubsp.longum為4個基因型,即分離自同一個體的菌株屬于同一ST型,與張秋雪等[13]對嬰兒糞便中長雙歧桿菌長亞種MLST分析結(jié)果一致。本研究中分離自同一W個體的3株分離株(W1、W3、W8)形成了3個ST型,與嬰兒源腸道中該菌種的MLST分析結(jié)果相比,成人源腸道該菌種具有更明顯的基因多態(tài)性。有研究表明長雙歧桿菌長亞種在人體中的定植受環(huán)境因素和宿主生理狀況及宿主基因型影響[23-24],這為解釋這一現(xiàn)象提供了理論依據(jù),表明不同個體的長雙歧桿菌長亞種之間存在較大的遺傳多樣性。

4 結(jié)論

本研究從12個健康成人糞便樣品中分離鑒定得到14株長雙歧桿菌長亞種菌株。經(jīng)多位點(diǎn)序列分型分析發(fā)現(xiàn),14株長雙歧桿菌長亞種分離株為10個基因型,分離自同一個體的分離株多為同一基因型,也出現(xiàn)了同一個體得到幾種不同ST型的情況,此結(jié)果說明不同人源成人腸道中長雙歧桿菌長亞種基因型差異較大,且存在基因多態(tài)性。