(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

雜環(huán)胺(Heterocyclicaromaticamines,HAAs)是富含蛋白質(zhì)的物質(zhì)在進(jìn)行熱加工時(shí)形成的一種物質(zhì)[1]。截至目前已經(jīng)在熟食中分離出了約30種誘變型雜環(huán)胺[2]。這些雜環(huán)胺可以分為氨基咪唑氮雜芳烴類(AIA)與氨基咔啉類[3]。肉類在日常飲食中必不可少,家庭條件下對(duì)肉類的烹調(diào)溫度一般在170～230 ℃[4],而兩類雜環(huán)胺中的氨基咪唑氮雜芳烴類的形成溫度范圍為100～300 ℃[5],所以,日常肉制品中易形成該類雜環(huán)胺。相關(guān)研究表明,如果長(zhǎng)時(shí)間攝入含有雜環(huán)胺的食品,患癌的幾率將會(huì)增加,尤其是結(jié)腸、乳腺以及肝臟方面的癌癥[6]。為確保食品安全,實(shí)現(xiàn)對(duì)雜環(huán)胺的快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)具有十分重要的意義。

目前,雜環(huán)胺的檢測(cè)手段主要有高效液相色譜[7]、液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]、氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]以及熒光檢測(cè)[12]等方法,這些檢測(cè)方法都有著靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn),但對(duì)儀器、操作過(guò)程以及財(cái)力的要求較高[13-15]。免疫分析方法對(duì)儀器的要求較低,并且具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)結(jié)果靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前關(guān)于采用免疫分析方法檢測(cè)雜環(huán)胺的報(bào)道較少,Martin等人[16]制備了PhIP的四種結(jié)構(gòu)類似物PhIP-1,-2,-3和-4的抗體,并對(duì)4種抗體之間的特異性和選擇性進(jìn)行了研究;Sheng等人[17]制備了IQ的抗體并建立了直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(dc-ELISA),這些方法只能夠針對(duì)雜環(huán)胺中的一種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),而雜環(huán)胺在肉制品中的含量較低,所以建立一種可以同時(shí)檢測(cè)肉制品中多種雜環(huán)胺的檢測(cè)方法具有重要意義。

本文主要針對(duì)廣譜性多克隆抗體的制備開展研究,以雜環(huán)胺2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)為原料,將其與丁二酸單甲酯酰氯(MCO)反應(yīng)合成雜環(huán)胺半抗原,通過(guò)活化酯法將半抗原與蛋白偶聯(lián)制備免疫原進(jìn)一步制備多克隆抗體,最終建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)。旨在建立能夠同時(shí)檢測(cè)多種雜環(huán)胺的酶聯(lián)免疫分析方法,為加工肉制品中雜環(huán)胺的檢測(cè)和監(jiān)控提供有用的工具。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(IQx)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(7,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-9H-吡啶[2,3-b]吲哚(AαC)、1-甲基-9H-吡啶[3,4-b]吲哚(Harman)、9H-吡啶[3,4-b]吲哚(Norharman)、丁二酸單甲酯酰氯(MCO)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 美國(guó)Sigma公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 美國(guó)Sigma公司;無(wú)水二氯甲烷 美國(guó)Sigma公司;甲醇(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;新西蘭大白兔 月齡3個(gè)月,體重1.5 kg左右,北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

NGC蛋白純化儀 美國(guó)BIO-RAD公司;96孔酶標(biāo)板 丹麥Nunc公司;F200 PRO酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原合成 在氮?dú)猸h(huán)境下,向20 mL溶解有0.1 mmol的2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)的無(wú)水二氯甲烷溶液中,逐滴加入0.3 mmol濃度為50.29 mmol/L的丁二酸單甲酯酰氯(MCO)-無(wú)水二氯甲烷溶液,冰浴反應(yīng)5 h后,室溫反應(yīng)過(guò)夜[18],薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)監(jiān)測(cè)(展開劑組分及比例為二氯甲烷∶無(wú)水甲醇∶氨水=9∶1∶0.1,V/V/V[19])。反應(yīng)完成后,用飽和NaHCO3溶液去除產(chǎn)物中的氫離子,并用無(wú)水Na2SO4干燥,過(guò)濾后60 ℃減壓旋蒸,獲得MeIQx半抗原。

1.2.2 偶聯(lián)蛋白及抗體制備 稱取1.0 mg半抗原和1.2 mg二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于0.1 mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,將其加入4 mL溶解有20 mg鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)的碳酸氫鈉溶液中,室溫?cái)嚢? h后,加入0.6 mg EDC,4 ℃反應(yīng)過(guò)夜[18]。將所得反應(yīng)溶液在4 ℃下用pH7.4的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析3 d,得到雜環(huán)胺免疫原MeIQx-KLH。以上述同樣的方法合成包被原MeIQx-OVA,通過(guò)紫外掃描(200～550 nm)進(jìn)行鑒定。采用多點(diǎn)皮下注射法免疫新西蘭大白兔,最后一次免疫后采用股動(dòng)脈采血法采集全血[20]。4 ℃進(jìn)行離心(10000 r/min,10 min),收集血清,通過(guò)ProteinA-Sepharose 4B親和柱層析法純化抗體。

1.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的建立

1.2.3.1 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(ic-ELISA)方法步驟 將包被原(100 μL/well)包被在96孔板上,4 ℃條件下過(guò)夜;用PBST洗板3次后,加入200 μL/well封閉液在37 ℃下封閉1 h;用PBST洗板3次后,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液(50 μL/well)和抗體(50 μL/well),在37 ℃環(huán)境中孵育1 h;用PBST洗板4次后,加入酶標(biāo)二抗(15000倍稀釋,100 μL/well),37 ℃孵育30 min;用PBST洗板5次后,加入底物溶液,37 ℃下顯色15 min;加入硫酸(1.25 mol/L,50 μL/well)終止反應(yīng),利用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm下讀取吸光度值,計(jì)算抑制率[21]。

1.2.3.2 包被抗原及抗體稀釋度的確定 選取0.01、0.05和0.1 μg/well的包被抗原量和不同稀釋倍數(shù)的抗體進(jìn)行組合,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定不同條件下的OD值,并計(jì)算相應(yīng)的抑制率和IC50值,選取吸光度值在1.0左右、IC50值最低時(shí)的條件為最佳包被量和抗體稀釋比例。

1.2.3.3 封閉液選擇及濃度優(yōu)化 確定包被量及抗體稀釋比例后,分別用0.5%和1%的明膠溶液、0.5%和1%的BSA溶液以及0.5%和1%的脫脂乳粉溶液作為封閉液進(jìn)行ELISA測(cè)定,最終選取吸光度值在1.0左右、IC50值最低時(shí)對(duì)應(yīng)的封閉液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 MeIQx質(zhì)譜信息Table 1 Mass spectrum information of MeIQx

1.2.3.4 甲醇對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的影響 考慮到進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)需要用甲醇對(duì)提取物進(jìn)行復(fù)溶,本實(shí)驗(yàn)使用含0、1%、3%、5%、10%、20%、40%的甲醇的PBS緩沖液,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察甲醇對(duì)ELISA方法的影響,最終選擇能夠完全溶解樣品提取物且與甲醇含量為0時(shí)的IC50值相近的甲醇-PBS混合液為樣品提取液。

1.2.3.5 雜環(huán)胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 在上述優(yōu)化條件下,梯度稀釋MeIQx標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定,得到不同濃度MeIQx所對(duì)應(yīng)的吸光度值,通過(guò)吸光度值計(jì)算抑制率,以MeIQx濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)進(jìn)行擬合得到S型標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)曲線計(jì)算得到本方法的靈敏度(IC50)和檢測(cè)限(IC15)。

1.2.4 雜環(huán)胺抗體特異性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)選取與雜環(huán)胺MeIQx結(jié)構(gòu)類似的喹啉類雜環(huán)胺IQ、MeIQ,喹喔啉類雜環(huán)胺IQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx,吡啶類雜環(huán)胺PhIP以及氨基咔啉類雜環(huán)胺AαC、Norharman和Harman進(jìn)行抗體特異性測(cè)定,以MeIQx的IC50和結(jié)構(gòu)類似物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為交叉反應(yīng)率。

1.2.5 樣品前處理方法 將牛肉切成碎末,制成直徑4 cm、厚0.5 cm的薄餅,在200 ℃下油炸2 min[22],然后將油炸過(guò)的牛肉和購(gòu)買的肉松在-80 ℃、0.35 Mpa的條件下進(jìn)行凍干處理(24 h),取凍干后的樣品1 g,放入50 mL離心管中,加入5 mL乙酸乙酯、2 mL氫氧化鈉溶液,震蕩后超聲萃取10 min,8000 r/min離心10 min,取上清,3 mL乙酸乙酯再次提取,合并上清,46 ℃氮吹至干,1 mL甲醇復(fù)溶[23],再加入1 mL正己烷,渦旋混合5 min,8000 r/min離心,取下層清液,46 ℃氮吹至干,用1 mL含有5%甲醇的甲醇-PBS混合液復(fù)溶得到樣品提取溶液。

1.2.6 提取液稀釋倍數(shù)優(yōu)化 將1.2.5方法處理得到的樣品提取溶液用PBS分別進(jìn)行2、4、8、16倍稀釋,通過(guò)對(duì)比建立的基質(zhì)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,選取基質(zhì)影響基本消除的稀釋倍數(shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 添加回收實(shí)驗(yàn) 向油炸牛肉和肉松樣品中分別添加60、100、300 μg/kg的MeIQx標(biāo)準(zhǔn)品,用方法1.2.5處理樣品,用建立的ic-ELISA方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率。

1.2.8 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)驗(yàn)證 參照林翠萍等[10]的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析法進(jìn)行驗(yàn)證。液相條件:色譜柱:Zorbax Eclipsw Plus C18柱,2.1 mm×100 mm,3.5(m;流速:0.2 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:1(L;分析時(shí)間:23 min;流動(dòng)相:A:10 mmol/L甲酸水(pH3.5,甲酸調(diào)節(jié));B:乙腈;流動(dòng)相梯度洗脫程序:0～12 min,90% A,10% B;12 min,40% A,60% B;14 min,90% A,10% B。

質(zhì)譜參數(shù):離子化模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);霧化氣和碰撞氣:N2;霧化氣壓力:40 psi;毛細(xì)管電壓:4000 V;干燥器溫度:350 ℃;干燥器流量:10 L/min;目標(biāo)物質(zhì)MeIQx的監(jiān)測(cè)離子對(duì)信息見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中,酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采用Origin 9.1軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原和完全抗原的鑒定

雜環(huán)胺MeIQx的分子質(zhì)量為213.24,MCO分子量為150.56,經(jīng)1.2.1反應(yīng)生成分子量為327.34的產(chǎn)物,圖1顯示有很明顯的328.53加氫峰即[M+H]+,MS(ESI)數(shù)據(jù)與化合物的分子量(327.24)吻合,合成產(chǎn)物為目標(biāo)化合物。將合成的半抗原分別偶聯(lián)KLH和OVA,得到免疫原MeIQx-KLH和包被原MeIQx-OVA。由圖2可以看出,二者的紫外最大吸收峰分別在274、271 nm處,在MeIQx半抗原的影響下,相對(duì)于純蛋白KLH和OVA的最大吸收峰位置(278 nm)均向左發(fā)生了偏移[23],后期產(chǎn)生的相應(yīng)抗體和建立的檢測(cè)方法也充分證明,免疫原MeIQx-KLH和包被原MeIQx-OVA偶聯(lián)成功。

圖1 MeIQx半抗原的質(zhì)譜分析圖Fig.1 Mass analysis diagram of hapten MeIQx

圖2 MeIQx-KLH免疫原和MeIQx-OVA包被原的紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of immunogenMeIQx-KLH and MeIQx-OVA

2.2 包被量及抗體稀釋度的確定

包被量及抗體稀釋度的優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出,包被量相同時(shí),隨著抗體稀釋倍數(shù)的增大,IC50值減小。針對(duì)不同包被量,當(dāng)包被量為0.05 μg/well、抗體稀釋倍數(shù)為1∶10000時(shí)對(duì)應(yīng)的IC50值最小,但此時(shí)的OD值小于0.8,不利于檢測(cè)。而當(dāng)包被量為0.05 μg/well、抗體稀釋倍數(shù)為1∶9000時(shí),對(duì)應(yīng)的OD值在1.0左右且IC50值較小,所以最佳包被量確定為0.05 μg/well,最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶9000。

圖3 包被量和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig.3 Optimization of the amout of immobilizedcoating-antigen and antibody concentration

2.3 封閉液的優(yōu)化

由圖4可以看出,封閉液的種類及其濃度對(duì)ELISA方法均有影響,當(dāng)用BSA和明膠溶液進(jìn)行封閉時(shí),IC50值均大于用乳粉溶液封閉時(shí)的IC50值,且用乳粉溶液進(jìn)行封閉時(shí)OD值在1.0左右,相對(duì)于1%乳粉作封閉液,0.5%乳粉作為封閉液時(shí)對(duì)應(yīng)的IC50值最小,因此選擇0.5%的乳粉封閉液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 封閉液的優(yōu)化Fig.4 The optimization of blocking solution

2.4 甲醇含量對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(ic-ELISA)方法的影響

為了將樣品提取物充分溶解,需要用含有一定量甲醇的甲醇-PBS混合液對(duì)提取物進(jìn)行復(fù)溶,但是甲醇會(huì)對(duì)ELISA方法的靈敏度產(chǎn)生影響。如圖5所示,甲醇含量為1%、3%及5%時(shí)的IC50值與甲醇含量為0時(shí)的IC50值比較接近,可見(jiàn)該范圍內(nèi)的甲醇含量對(duì)ELISA方法的影響不明顯;當(dāng)甲醇含量達(dá)到10%時(shí),IC50值開始變大,并且隨著甲醇濃度的增大,OD值開始下降、IC50值明顯增大,說(shuō)明10%以上的甲醇含量會(huì)對(duì)ELISA方法產(chǎn)生影響。但鑒于甲醇含量越多,越有助于樣品提取物的溶解,所以本實(shí)驗(yàn)選取含有5%甲醇的PBS緩沖液復(fù)溶樣品提取物。

圖5 甲醇含量對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法的影響Fig.5 The influence of methanol concentration on ic-ELISA

2.5 雜環(huán)胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)曲的建立

經(jīng)過(guò)上述一系列的優(yōu)化,所建立的MeIQx雜環(huán)胺間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的最優(yōu)工作條件為:0.05 μg/well包被抗原、1∶9000稀釋抗體、0.5%乳粉作為封閉液。在上述條件下,按照1.2.3.1方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)四參數(shù)擬合得到S型標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示,

曲線方程為y=95.11452+(-1.38549-95.11452)/[1+(x/70.25321)0.9012](R2=0.99984),通過(guò)計(jì)算得出本方法的靈敏度IC50=81.16±3.15 μg/L,檢測(cè)限IC15=12.07±1.43 μg/L。

圖6 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of MeIQx by ic-ELISA

2.6 雜環(huán)胺抗體特異性測(cè)定

配制與MeIQx結(jié)構(gòu)類似的其他幾種雜環(huán)胺(IQ、MeIQ、IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx、PhIP、AαC、Norharman和Harman)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用建立的ELISA進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定IC50值并計(jì)算交叉反應(yīng)率,考察所制備的雜環(huán)胺抗體對(duì)其他雜環(huán)胺的識(shí)別能力,由表2可以看出,MeIQx抗體可以對(duì)喹啉類雜環(huán)胺(IQ、MeIQ)、喹喔啉類雜環(huán)胺(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx)以及吡啶類雜環(huán)胺(PhIP)進(jìn)行識(shí)別,與上述各種雜環(huán)胺的交叉反應(yīng)率均在93%以上;而對(duì)氨基咔啉類雜環(huán)胺(以AαC、Norharman和Harman為例)沒(méi)有明顯的識(shí)別能力。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所制備的MeIQx抗體能夠識(shí)別大部分氨基咪唑氮雜芳烴類雜環(huán)胺,具有很好的廣譜性,所建立的方法可以對(duì)食品中的喹啉類雜環(huán)胺、喹喔啉類雜環(huán)胺以及吡啶類雜環(huán)胺的總量進(jìn)行檢測(cè)。

表2 交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果Table 2 The result of cross-reactivity

2.7 提取液稀釋倍數(shù)優(yōu)化

續(xù)表

基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本吻合,基質(zhì)影響消除,因此,油炸牛肉樣品提取液經(jīng)4倍稀釋后可以用來(lái)進(jìn)行ELISA檢測(cè);不同稀釋倍數(shù)的肉松樣品提取液所對(duì)應(yīng)的基質(zhì)曲線如圖7(B)所示,由圖7(B)可以看出,2倍稀釋肉松樣品提取液時(shí),基質(zhì)曲線偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn),說(shuō)明此時(shí)的基質(zhì)影響比較明顯,對(duì)提取液稀釋4、8及16倍時(shí),基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本吻合,基質(zhì)影響消除,因此,肉松樣品提取液經(jīng)4倍稀釋后可以用來(lái)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

表3 ELISA和LC-MS/MS的回收試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The recovery experiment results of ELISA and LC-MS/MS(n=3)

圖7 油炸牛肉樣品(A)和肉松樣品(B)的稀釋度優(yōu)化Fig.7 Dilution optimization of fried beef sample(A)and dried meat floss(B)

2.8 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以本文建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)為檢測(cè)手段,對(duì)油炸牛肉樣品和肉松樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示。由表3可知,ic-ELISA測(cè)得的添加回收率在91.18%～98.64%之間,LC-MS/MS法測(cè)得的添加回收率在86.69%～91.11%之間。對(duì)ic-ELISA測(cè)得的添加回收率與LC-MS/MS法測(cè)得的添加回收率進(jìn)行線性回歸分析見(jiàn)圖8。由圖8可以看出,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有較好的一致性(R2=0.9927)。此外,對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)和LC-MS/MS法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)可以發(fā)現(xiàn),間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA)的回收率高于LC-MS/MS法,其原因可能在于ELISA方法的樣品前處理方法簡(jiǎn)單,不需要經(jīng)過(guò)固相萃取等復(fù)雜的提取步驟,樣品中的雜環(huán)胺標(biāo)準(zhǔn)品損失較少,由此可見(jiàn),用ic-ELISA在對(duì)雜環(huán)胺進(jìn)行檢測(cè)時(shí),操作簡(jiǎn)單且結(jié)果較為準(zhǔn)確。

圖8 油炸牛肉樣品和肉松樣品ELISA和LC-MS/MS回收試驗(yàn)結(jié)果的一致性分析Fig.8 Consistency analysis of ELISA and LC-MS/MS recovery experiment results of fried beef samples and dried meat floss

3 結(jié)論

本文通過(guò)合成雜環(huán)胺半抗原,制備了雜環(huán)胺免疫原并獲得了廣譜性雜環(huán)胺多克隆抗體,本文利用該抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA),方法靈敏度(IC50,以MeIQx計(jì))為81.16 μg/L,檢測(cè)限(IC15)為12.07 μg/L。該抗體能夠廣譜識(shí)別喹啉類雜環(huán)胺(IQ、MeIQ)、喹喔啉類雜環(huán)胺(IQx、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx、4,7,8-TriMeIQx)以及吡啶類雜環(huán)胺(PhIP),交叉反應(yīng)率均在93%以上;此外,本文建立的ic-ELISA對(duì)油炸牛肉和肉松樣品中雜環(huán)胺(MeIQx)的添加回收率均在91.18%以上,并且該方法的檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS法檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性(R2=0.9927)。綜上,本文所建立的雜環(huán)胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法可以對(duì)加工肉制品中喹啉類、喹喔啉類以及吡啶類雜環(huán)胺的總量進(jìn)行準(zhǔn)確、快捷的檢測(cè),可以為安全的飲食提供保障。在以后的研究中,還可以利用該抗體能夠識(shí)別喹啉類、喹喔啉類以及吡啶類雜環(huán)胺這一廣譜性特點(diǎn),可以開展更廣泛的應(yīng)用,建立更加快速、更加靈敏的新型檢測(cè)方法。