班芳芳,胡梁斌,莫海珍,趙巖巖,李紅波,周 威

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是常見(jiàn)的食源性致病菌,可導(dǎo)致食物中毒。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性病原菌,它能引起從呼吸系統(tǒng)到皮膚的各種感染[1]。大腸桿菌是生活在人類腸道中兼性厭氧的革蘭氏陰性菌。一些特殊血清型的大腸桿菌會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道和外源性感染,引起腸道(腸炎、腹瀉或痢疾)或腸外疾病(尿路感染、敗血癥或腦膜炎)[2]。近年來(lái)由于抗生素的濫用,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌耐藥頻率增加,特別是一些多重耐藥(Multi drug resistance,MDR)菌,如耐甲氧西林(Methicillin-resistantS.aureus,MRSA)[3]。耐藥菌感染問(wèn)題已經(jīng)給人們帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

開(kāi)發(fā)新藥是解決以上問(wèn)題的出路,其中天然活性成分由于低毒及良好的抑菌活性受到研究者的青睞。而對(duì)于那些抑菌作用相對(duì)較弱的生物活性物質(zhì),各種成分之間的復(fù)配是增強(qiáng)抑菌作用的一種很好的方式[4-5]。本實(shí)驗(yàn)中所用的天然活性成分分別為異硫氰酸芐酯(Benzyl isothiocyanate,BITC)、麝香草酚(Thymol)和乳酸鏈球菌素(Nisin),它們都是經(jīng)聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織(The Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)批準(zhǔn)可在食品中使用的一種食品添加劑。BITC是從金蓮花和水芹及其他的一些十字花科植物中分離得到的,可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)菌膜完整性的喪失來(lái)控制細(xì)菌的感染[6]。Thymol是廣泛存在于百里香屬、羅勒屬、牛至屬、香薄荷屬、延布拉屬和美國(guó)薄荷屬等唇形科植物精油的主要單萜酚,易揮發(fā),具有抗氧化劑[7]、抗炎[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10]、抗菌作用[11]。Thymol的殺菌機(jī)理在于它可使細(xì)胞膜發(fā)生膜穿孔,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的泄露[12]。Nisin是從乳球菌中分離出來(lái)的一種無(wú)味、無(wú)色、低毒的天然抗菌肽,其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較高的抗菌活性,比如李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳桿菌、滕黃微球菌和黃色微球菌[13-18]。但是這三種活性成分之間的復(fù)配及復(fù)配后的抑菌作用尚未有人研究,本文將采用復(fù)配的方法來(lái)研究它們對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。利用棋盤(pán)法將異硫氰酸芐酯、乳酸鏈球菌素和麝香草酚兩兩之間進(jìn)行復(fù)配,并結(jié)合基于LA理論非參數(shù)模型的FICI模型和BI理論非參數(shù)模型的ΔE模型對(duì)抑菌結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為天然活性成分的抑菌研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)、大腸桿菌MG1655(E.coliMG1655) 美國(guó)賓西法尼亞大學(xué);Nisin、Thymol、BITC和DMSO Sigma公司。

ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩箱 中國(guó)智城分析儀器制造有限公司;BE-9010微孔板恒溫振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;SW-CJ-2F D雙人單面垂直凈化工作臺(tái) 中國(guó)蘇州智凈凈化有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠;Pico 17高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;WFJ 7200型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;HVE-50高壓滅菌器 Hirayama Manufacturing Corporation;PL303電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的活化:將保存在-80 ℃冰箱中的S.aureusATCC25923和E.coliMG1655取出,取少許菌液冰碴分別在TSB和LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種,37 ℃靜置、過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.2 天然活性成分單用的抑菌活性測(cè)定 挑取S.aureusATCC25923和E.coliMG1655單克隆于無(wú)菌的TSB和LB液體培養(yǎng)基中,并在37 ℃、200r/min的條件下進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng),然后按照體積比200∶1(TSB液體培養(yǎng)基∶菌液)進(jìn)行轉(zhuǎn)接,待其OD600=0.8～1.0時(shí),調(diào)菌液OD600=0.1,然后在此基礎(chǔ)上稀釋100倍備用。將BITC與Thymol用DMSO溶劑稀釋;Nisin用0.02 mol/L的稀鹽酸稀釋,分別配制成不同梯度濃度的溶液,即BITC為0、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL;Thymol為0、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL;Nisin為0、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL。體系中DMSO的劑量均不高于1%。最后將配置好的一系列梯度濃度的活性成分分別吸取5 μL加至含有195 μL菌液稀釋液的96孔板中(200 μL體系),于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下96孔板中各菌孔的OD600值,計(jì)算細(xì)菌生長(zhǎng)率。

生長(zhǎng)率(%)=(各試驗(yàn)孔OD值/空白對(duì)照孔OD值)×100。

1.2.3 天然活性成分兩兩聯(lián)用的抑菌活性測(cè)定 藥物相互作用模型。為了評(píng)估3種天然活性成分對(duì)兩種菌株的體外相互作用,本文采用基于兩種無(wú)交互理論的非參數(shù)化方法LA理論和BI理論對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[19]。

BI模型:BI方程所描述的理論可用等式Ii=IA+IB-IA×IB來(lái)表示,Ii是藥物A和B理論上非相互作用結(jié)合的抑菌率,IA和IB是藥物A和B單用時(shí)的實(shí)際抑菌率。而I=1-E,E是生長(zhǎng)率,通過(guò)替換到原方程,方程推導(dǎo)如下:Ei=EA×EB,Ei是藥物A和B理論上非相互作用結(jié)合的生長(zhǎng)率,EA和EB是藥物A和B單用時(shí)的實(shí)際生長(zhǎng)率。不同濃度組合相互作用的類型可以通過(guò)藥物在不同濃度下理論和實(shí)際生長(zhǎng)百分比之間的差異(ΔE)來(lái)描述。若平均ΔE>0,則有95%的可能性說(shuō)明此濃度組合有協(xié)同作用;相反,若平均ΔE<0,則有95%的可能性說(shuō)明此濃度組合有拮抗作用。而不同濃度組合的總體聯(lián)用效果可以通過(guò)顯著協(xié)同(∑SYN)和拮抗(∑ANT)相互作用的總和百分比來(lái)評(píng)價(jià)。若顯著相互作用總和小于100%,被認(rèn)為是弱相互作用;顯著相互作用在100%～200%,被認(rèn)為是中等相互作用,顯著相互作用在200%以上,被認(rèn)為是強(qiáng)相互作用。

圖1 BITC、Nisin與Thymol分別對(duì)S. aureus ATCC25923和E. coli MG1655的最小抑菌濃度Fig.1 MIC of BITC,Nisin and Thymol against S. aureus ATCC25923 and E. coli MG1655注:A、C、E分別為BITC、Nisin、Thymol對(duì)S. aureus ATCC25923的最小抑菌濃度;B、D、F分別為BITC、Nisin、Thymol對(duì)E. coli MG1655的最小抑菌濃度。

在96孔板每個(gè)孔內(nèi)加入190 μL菌液稀釋液,然后將稀釋好的BITC與Nisin各吸取5 μL,按照棋盤(pán)法進(jìn)行交叉組合。Thymol與Nisin、Thymol與BITC也分別進(jìn)行同樣的交叉組合,并將活性成分組合后的96孔板放至37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,然后測(cè)量各個(gè)96孔板的OD600值,并根據(jù)以上的評(píng)價(jià)模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖,其中的最小抑菌濃度曲線由OriginPro 8.5軟件繪制。每個(gè)處理組進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BITC、Nisin與Thymol單用時(shí)的抑菌作用

利用微量稀釋法測(cè)定BITC、Nisin和Thymol分別對(duì)S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的最小抑菌濃度。由圖1可以看出,BITC、Nisin和Thymol對(duì)S.aureusATCC25923最小抑菌濃度分別為64、256、256 μg/mL;而對(duì)E.coliMG1655的最小抑菌濃度分別為128、>8、256 μg/mL。

2.2 BITC、Nisin與Thymol兩兩聯(lián)用時(shí)的抑菌效應(yīng)

BITC、Nisin和Thymol單用及聯(lián)用時(shí)的抑菌活性結(jié)果如表1所示。BITC、Nisin與Thymol單用時(shí)對(duì)S.aureusATCC25923的IC50分別是32、128和128 μg/mL。當(dāng)BITC、Nisin與Thymol兩兩聯(lián)用時(shí),BITC的使用濃度由32 μg/mL降至最低8 μg/mL;Nisin的使用濃度由128 μg/mL最低降至8 μg/mL;Thymol的使用濃度由128 μg/mL降至最低32 μg/mL。BITC、Thymol與Nisin單用時(shí)對(duì)E.coliMG1655的IC50分別是64、384和16384 μg/mL。當(dāng)BITC、Thymol與Nisin兩兩聯(lián)用時(shí),BITC的使用濃度由64 μg/mL最低降至16 μg/mL;Nisin的使用濃度由128 μg/mL最低降至8 μg/mL;Thymol的使用濃度由384 μg/mL降至最低64 μg/mL。結(jié)果表明,三種天然活性成分兩兩聯(lián)用可以降低其各自的抑菌使用劑量。

表1 BITC、Nisin和Thymol單用及聯(lián)用時(shí)的抑菌活性Table1 Antibacterial activity of BITC,nisin and thymol exposed alone and in combination

表2 Nisin、BITC與Thymol體外兩兩聯(lián)用效果Table 2 In vitro interaction among BITC,nisin and thymol

表3 S. aureus ATCC25923經(jīng)Nisin-BITC處理后的生存率Table 3 Survival rate of S. aureus ATCC25923 treated with Nisin-BITC compound

2.2.1 BITC-Nisin之間的抑菌效應(yīng) 基于LA理論非參數(shù)模型的FICI法,通過(guò)計(jì)算可知,BITC-Nisin聯(lián)用時(shí)對(duì)S.aureusATCC25923表現(xiàn)出協(xié)同抑菌效應(yīng)(FICI指數(shù)小于0.5,如表2所示),對(duì)E.coliMG1655則無(wú)相互作用(FICI指數(shù)大于0.5,如表2所示),其協(xié)同抑菌效果分別如表3和圖2A所示;基于BI理論非參數(shù)模型的ΔE法,可知BITC-Nisin聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923表現(xiàn)出強(qiáng)協(xié)同抑菌作用(∑SYN=537.57,表2),而對(duì)E.coliMG1655則表現(xiàn)出弱拮抗作用(∑ANT=85.83,如表2所示),分別如圖2B和2C所示。兩種評(píng)價(jià)模型表現(xiàn)出較好的一致性。

圖2 BITC-Nisin對(duì)S. aureus ATCC25923的抑菌效應(yīng)定量分析Fig.2 Quantitative analysis of antibacterial effect ofS. aureus ATCC2592 exposed to BITC and nisin注:A為基于LA理論非參數(shù)模型下的50%抑菌濃度等效點(diǎn)圖;B和C分別為基于BI理論非參數(shù)模型下的BITC-Nisin抑菌的3-D立體指數(shù)圖曲面圖和俯視圖。

2.2.2 Nisin-Thymol之間的抑菌效應(yīng) 如表2所示,Nisin-Thymol聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923的FICI值為0.58,∑SYN=288.07,∑ANT=-307.80;對(duì)E.coliMG1655的FICI值為0.5007,∑SYN=165.07,∑ANT=-110.07。無(wú)論是利用FICI法還是ΔE法對(duì)結(jié)果進(jìn)行模型評(píng)估,Nisin-Thymol聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923和E.coliMG1655均未表現(xiàn)出協(xié)同作用,即Nisin-Thymol聯(lián)用并沒(méi)有提高Nisin或Thymol對(duì)S.aureusATCC25923和E.coliMG1655的抑菌效應(yīng)。

2.2.3 BITC-Thymol之間的抑菌效應(yīng) 當(dāng)利用FICI法進(jìn)行模型評(píng)估時(shí),BITC-Thymol聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923和E.coliMG1655也均未表現(xiàn)出協(xié)同作用(FICI值均大于0.5),而當(dāng)利用ΔE法進(jìn)行模型評(píng)估BITC-Thymol聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923表現(xiàn)出強(qiáng)拮抗作用(∑SYN=0,∑ANT=-219.86);對(duì)E.coliMG1655表現(xiàn)出強(qiáng)協(xié)同作用(∑SYN=274.77,∑ANT=-19.14),兩種模型評(píng)價(jià)的結(jié)果不一致。

3 討論

為提高天然活性成分對(duì)食源性致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果,本文采用棋盤(pán)法并結(jié)合數(shù)學(xué)評(píng)估模型研究了其兩兩聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923和E.coliMG1655是否具有協(xié)同抑菌作用。結(jié)果表明,Nisin-BITC聯(lián)用對(duì)S.aureusATCC25923表現(xiàn)出了很好的協(xié)同效應(yīng)。除了Nisin-BITC組合,其他組合均未表現(xiàn)出協(xié)同抑菌效果,這可能是因?yàn)閮烧咭志鷻C(jī)制的不同所導(dǎo)致的。Nisin是一種由核糖體合成,后經(jīng)翻譯修飾的含有34個(gè)氨基酸的抗菌肽,該多肽含有一個(gè)硫化雙丙氨酸,4個(gè)β-甲基-硫化雙丙氨酸環(huán)和一些不常見(jiàn)的殘基,如脫氫丙氨酸、脫氫酪氨酸[22-24]。其抗菌活性與它和細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上陰離子脂質(zhì)的相互作用有關(guān),從而導(dǎo)致等離子體膜的擾亂。Nisin陰離子脂質(zhì)相互作用形成的孔隙會(huì)導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸、預(yù)積累的銣或重要離子流失,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15,25],它和細(xì)胞質(zhì)膜的相互作用由兩種不同的機(jī)制產(chǎn)生。第一種機(jī)制,在微摩爾范圍內(nèi),Nisin結(jié)合膜上的陰離子脂質(zhì)表現(xiàn)出一種低親和力的滲透;第二種機(jī)制中,在摩爾范圍內(nèi),Nisin通過(guò)特異性識(shí)別與細(xì)胞靶膜中的脂質(zhì)II相互作用,然后由4個(gè)脂質(zhì)II分子和8個(gè)Nisin分子組成的脂質(zhì)II依賴通路形成孔隙[11,15]。脂質(zhì)II介導(dǎo)的孔復(fù)合體比無(wú)脂質(zhì)II形成的孔更穩(wěn)定[26]。而B(niǎo)ITC也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌膜完整性的喪失,但是其破膜作用只表現(xiàn)在革蘭氏陰性菌上,它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌只表現(xiàn)出了抑制作用,這很有可能就是BITC和Nisin發(fā)揮協(xié)同作用的主要原因。它們?cè)谝志^(guò)程中的協(xié)同機(jī)制還有待驗(yàn)證和探索。

對(duì)于聯(lián)合用藥評(píng)估模型的方法,除了基于LA理論非參數(shù)模型的FICI法[20]和BI理論非參數(shù)模型的ΔE法[27],還有同樣基于LA理論全參數(shù)濃度效應(yīng)響應(yīng)曲面法和BI理論半?yún)?shù)濃度效應(yīng)響應(yīng)面方法。E是藥物濃度為DA和DB(自變量)時(shí)的OD值(因變量);Emax未加藥物處理的空白對(duì)照組的最大OD值;IC50,A和IC50,B分別是藥物A和B抑制50%菌量時(shí)的濃度,在數(shù)值上是Emax的50%;mA和mB分別是藥物A和B濃度效應(yīng)曲線(Hill系數(shù))的斜率;α是用來(lái)描述天然相互作用的參數(shù)。當(dāng)參數(shù)α為正且95%置信區(qū)間不含0時(shí),有顯著協(xié)同作用,當(dāng)參數(shù)為負(fù)且95%置信區(qū)間不含0時(shí),有顯著拮抗作用。E、D、Emax、IC50和m跟上述藥物A和B參數(shù)相同。當(dāng)ΔE為正且95%置信區(qū)間不包含0時(shí),稱顯著協(xié)同作用;當(dāng)ΔE為負(fù)且95%置信區(qū)間不含0時(shí),稱顯著拮抗作用。

相關(guān)數(shù)據(jù)表明,BITC、Thymol和Nisin單用的使用量超出一定范圍時(shí)具有毒性作用。TOXNEP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://toxnet.nlm.nih.gov/)中ChemIDplus庫(kù)的數(shù)據(jù)顯示,Thymol在小鼠中靜脈注射的LD50>110 mg/kg時(shí)會(huì)出現(xiàn)嗜睡,運(yùn)動(dòng)失調(diào);BITC在小鼠中皮下注射的LD50>150 mg/kg時(shí)會(huì)導(dǎo)致癲癇發(fā)作;Nisin在小鼠中靜脈注射的正常使用劑量LD50為100 mg/kg,超出此劑量可能會(huì)存在潛在毒性作用。但是三者相互之間復(fù)配后的毒性數(shù)據(jù)尚無(wú)收錄,也無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。復(fù)配物之間若存在協(xié)同作用,會(huì)降低各使用成分的濃度,理論上會(huì)降低各自的毒性。李宏等發(fā)現(xiàn)[28]將含油橄欖葉提取物與化學(xué)殺菌劑二氯苯氧氯酚復(fù)配后可能存在協(xié)同抑菌作用,其復(fù)配物的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無(wú)毒。顧松山等[29]發(fā)明了一種含有苯噻菌酯和滅菌唑的滅菌組合物,取得了非常顯著的協(xié)同增效作用,且經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明,復(fù)配后對(duì)哺乳動(dòng)物毒性未有增加。這都與理論相符,但本文所研究的三種活性成分相互之間的復(fù)配物的毒性是否具有協(xié)同作用仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本文結(jié)果表明,異硫氰酸芐酯復(fù)配物-乳酸鏈球菌素的FICI值為0.29<0.5,∑ΔE值的絕對(duì)值為451.74%>200%,評(píng)價(jià)結(jié)果為強(qiáng)協(xié)同作用;乳酸鏈球菌素-麝香草酚復(fù)配物的FICI值為0.58>0.5,∑ΔE值的絕對(duì)值為19.73%<100%,評(píng)價(jià)結(jié)果為弱拮抗作用;異硫氰酸芐酯-麝香草酚復(fù)配物的FICI值為1.50>0.5,∑ΔE值的絕對(duì)值為219.86%>200%,評(píng)價(jià)結(jié)果為強(qiáng)拮抗作用。除了乳酸鏈球菌素-異硫氰酸芐酯復(fù)配物對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923具有強(qiáng)協(xié)同抑菌作用,其他組合協(xié)同抑菌效果均不明顯。本研究為控制食源性致病菌S.aureus的感染提供了一個(gè)天然活性成份復(fù)配的配方,即Nisin和BITC復(fù)配時(shí)的IC50濃度均為8 μg/mL。