,*

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510300;2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510641;3.廣東太陽(yáng)神集團(tuán)有限公司,廣東廣州 510665)

猴頭菇[Hericiumerincaceus(Bull.:Fr.)Pers],又稱(chēng)猴頭蘑、猴頭菌、刺猬菌等,屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、齒菌科(Hydnaceae)、猴頭屬(Hericium)[1],因其子實(shí)體圓而厚且與猴子頭部相似而得名。猴頭菇中含有多肽類(lèi)、多糖類(lèi)、萜類(lèi)、甾醇類(lèi)、酚類(lèi)等活性成分,具有抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、保肝等多種生物活性[2-3]。

隨著天然產(chǎn)物研究的深入和分離純化方法的不斷改進(jìn),已有相關(guān)研究報(bào)道了從猴頭菇中分離純化得到化合物,并進(jìn)行了相關(guān)的結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性評(píng)價(jià)研究,使得猴頭菇中的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)得到了豐富。例如Kawagishi等[4-6]以猴頭菇菌絲體為原料,分離出7種二萜類(lèi)物質(zhì),分別稱(chēng)之為Erinacine A、B、C、D、E、F、G,這種二萜類(lèi)物質(zhì)以鳥(niǎo)巢烷型二萜(Cyathane)骨架為基本構(gòu)型,普遍具有抗菌、抗炎和刺激神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)合成等生物活性。Kawagishi等[7]還從猴頭菇子實(shí)體中分離純化得到3個(gè)酚類(lèi)物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定以及活性研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些化合物具有較強(qiáng)的促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成的活性。麻兵繼等[8]以猴頭菇子實(shí)體為原料,利用柱色譜技術(shù)從其甲醇浸提物中分離純化得到11個(gè)化合物,其中包含2個(gè)甾醇類(lèi)化合物。Li等[9]從猴頭菇子實(shí)體中分離得到14種甾醇,包括4種新的甾醇和10種已知的甾醇,而甾醇類(lèi)化合物具有較好的抗病毒、利尿、抗腫瘤以及保護(hù)胃黏膜作用。

本課題組前期的研究結(jié)果表明[10],猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物均具有一定的抗氧化活性,其中乙酸乙酯相的抗氧化活性相對(duì)較高,對(duì)DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別為41.64%(2.5 mg/mL)、82.84%(2.5 mg/mL)和89.18%(0.5 mg/mL)。由此可見(jiàn),猴頭菇醇提物的乙酸乙酯相萃取組分具有較好的抗氧化活性,具有較好的繼續(xù)研究?jī)r(jià)值。但是目前對(duì)于猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物中的單體化合物的分離鑒定和活性研究尚缺乏相關(guān)數(shù)據(jù),對(duì)于乙酸乙酯相中的主要功效化合物仍有待進(jìn)一步研究。而獲取這部分研究數(shù)據(jù)的前提是需要通過(guò)相關(guān)分離手段獲取化合物單體。

基于上述背景,本文以猴頭菇子實(shí)體為原料,在前期研究[10]的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相進(jìn)行分離鑒定研究,采用硅膠柱層析和半制備HPLC法對(duì)其進(jìn)行分離純化,將純化得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和鑒定,為猴頭菇中的單體化合物分離以及后續(xù)功效實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),以期為猴頭菇資源的深度開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇子實(shí)體 產(chǎn)自吉林省長(zhǎng)白山二道白河;氘帶甲醇 美國(guó)Sigma公司;石油醚、乙酸乙酯、甲醇、香草醛、濃硫酸等試劑 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZF-90D暗箱式紫外分析儀 上海光豪分析儀器有限公司;BSZ-160F電腦自動(dòng)部份收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;島津LC-20AB分析型高效液相色譜儀 日本島津公司;島津LC-20AR半制備型高效液相色譜儀 日本島津公司;Esquire HCT PLUS質(zhì)譜儀 德國(guó)Bruker公司;AVANCE-III HD600超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的制備 參考黃越等[10]的方法并稍作改動(dòng),按如下流程制備猴頭菇醇提物及其乙酸乙酯萃取組分。具體制備方法如下:

猴頭菇醇提物制備流程:將猴頭菇子實(shí)體切成小塊,然后置于50 ℃下干燥16 h,期間不斷翻動(dòng)以保證干燥均勻,稱(chēng)取一定量干燥至恒重的猴頭菇子實(shí)體干粉,按以下工藝制備猴頭菇醇提物:乙醇濃度50%,料液比1∶15 g/mL,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間5 h,提取2次,合并2次提取液,在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,收集上清液并在45 ℃條件下旋蒸濃縮2～3 h,直至不再有液體旋出,獲得猴頭菇醇提物。

猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的制備流程:將猴頭菇醇提物與少量蒸餾水進(jìn)行混合,振蕩均勻后形成水懸浮液。分級(jí)萃取時(shí)選取的有機(jī)溶劑依次為石油醚、乙酸乙酯,石油醚萃取操作時(shí)按1∶1 (V/V)與水懸浮液進(jìn)行混合,振蕩10 min后靜置進(jìn)行萃取,收集石油醚相,剩余相再次用石油醚萃取,重復(fù)2次,共萃取3次。剩余水相用乙酸乙酯萃取3次,收集得到猴頭菇醇提物乙酸乙酯相,在45 ℃條件下旋蒸濃縮2～3 h,直至不再有液體旋出,置于-20 ℃下儲(chǔ)存。

1.2.2 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的粗分離 采用硅膠柱層析法對(duì)猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相進(jìn)行粗分離,選用規(guī)格為Φ6.0 cm×60 cm的層析柱,采用柱層析用硅膠(100～200目)進(jìn)行濕法裝柱。取猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相組分30 g,用適量乙酸乙酯將其完全溶解,加入樣品重量1.5倍的硅膠(100～200目)充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｔ谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器里于45 ℃條件下旋干混勻,進(jìn)行干法上樣。

根據(jù)乙酸乙酯相TLC顯色結(jié)果確定洗脫劑系統(tǒng)組成。依次采用純石油醚、不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(99∶1、98∶2、95∶5、90∶10、80∶20和50∶50,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(19∶1、9∶1和1∶1,V/V)、純甲醇一系列溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為3500 mL。等量逐份收集洗脫液,用250 mL錐形瓶進(jìn)行收集,每200 mL收集一次,一共得到A1～A210共210個(gè)組分。用毛細(xì)管將得到的210個(gè)組分快速準(zhǔn)確地點(diǎn)樣于GF-254薄層硅膠板上,吹干,用適當(dāng)?shù)恼归_(kāi)劑展開(kāi),然后取出吹干,再使用紫外燈、碘和香草醛-硫酸顯色劑進(jìn)行顯色。觀察各個(gè)斑點(diǎn)的相對(duì)比移值(Rf),對(duì)比分析,將相似組分合并進(jìn)行再分離純化。通過(guò)TLC顯色結(jié)果分析,將A36～A81合并作為組分C1,A82～A91合并作為組分C2,A92～A106合并作為組分C3,A107～A115合并作為組分C4,A116～A128合并作為組分C5,A129～A136合并作為組分C6,A137～A143合并作為組分C7,A145～A168合并作為組分C8,A169～A185合并作為組分C9,A186～A210合并作為組分C10。將組分C1～C10在45 ℃條件下旋蒸濃縮3～5 h,直至不再有液體旋出,得到組分C1～C10,以待后續(xù)進(jìn)行分離純化。

1.2.3 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的細(xì)分離

1.2.3.1 組分C6的分離純化 硅膠柱層析對(duì)組分C6的分離:選用規(guī)格為Φ2.6 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進(jìn)行濕法裝柱。稱(chēng)取2.0 g樣品,進(jìn)行干法上樣,依次用不同混合比例的石油醚與乙酸乙酯混合比例(10∶1、8∶1、5∶1和1∶1,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(5∶1和5∶4,V/V)一系列溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為750 mL。等量逐份依次收集洗脫液,通過(guò)TLC顯色結(jié)果分析,合并相似組分,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮20～50 min,得到4個(gè)組分C6-1、C6-2、C6-3和C6-4。

半制備型HPLC對(duì)組分C6-2的分離:稱(chēng)取800 mg組分C6-2充分溶于甲醇,過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜,采用以下條件進(jìn)行分析與制備。HPLC條件:分析型色譜柱:島津C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL;分析時(shí)間:50 min,采用梯度洗脫分析。半制備HPLC條件:半制備型色譜柱:LC spherical-C18柱(7 μm,20 mm×300 mm);流速:8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:1 mL;分析時(shí)間:80 min,使用梯度洗脫程序進(jìn)行分離操作,洗脫程序如表1所示。

表1 組分C6-2的半制備HPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions for fractionC6-2 with semi-preparative HPLC

1.2.3.2組分C7的分離純化 采用硅膠柱層析對(duì)組分C7進(jìn)行分離,選用規(guī)格為Φ1.5 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進(jìn)行濕法裝柱。稱(chēng)取1.0 g樣品進(jìn)行干法上樣。采用不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5和1∶9,V/V)、純乙酸乙酯、不同乙酸乙酯與甲醇混合比例(95∶2、90∶5、90∶10和1∶1,V/V)和純甲醇一系列溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為250 mL。用電腦自動(dòng)部分收集器等量逐份收集洗脫液,經(jīng)TLC檢測(cè)分析,合并相似組分,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮1～2 h,直至不再有液體旋出,得到8個(gè)組分C7-1、C7-2、C7-3、C7-4、C7-5、C7-6、C7-7、C7-8。

硅膠柱層析對(duì)組分C7-3的分離:選用規(guī)格為Φ 1.5 cm×80 cm的層析柱,用200～300目柱層析用硅膠進(jìn)行濕法裝柱。將組分C7-3(0.128 g)進(jìn)行干法上樣。依次用不同石油醚與乙酸乙酯混合比例(1∶4.5、1∶5、1∶7和1∶9,V/V)和純乙酸乙酯一系列溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,每種洗脫劑用量均為100 mL。用電腦自動(dòng)部分收集器等量逐份收集洗脫液,經(jīng)TLC檢測(cè)分析,合并相似組分。并在45 ℃條件下旋蒸濃縮20～50 min,得到3個(gè)組分C7-3-1、C7-3-2和C7-3-3。

1.2.3.3組分C8的分離純化 稱(chēng)取組分C8共2.0 g充分溶解于甲醇中,過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜,采用以下條件進(jìn)行分析與制備。

分析HPLC條件:分析型色譜柱:島津C18柱(5 μm,4.6 mm×150 mm);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL;分析時(shí)間:50 min,采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離操作。

半制備HPLC條件:半制備型色譜柱:LC spherical-C18柱(7 μm,20 mm×300 mm);流速:8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:1 mL;分析時(shí)間:80 min,采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離,洗脫程序如表2所示。

表2 組分C8的半制備HPLC梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution conditions for fraction C8with semi-preparative HPLC

1.2.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與分析

1.2.4.1 質(zhì)譜分析(ESI-MS) 各取少量化合物H1、H2、H3、H4、H5,分別用色譜純甲醇進(jìn)行充分溶解,通過(guò)Esquire HCT PLUS型大容量離子阱對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析,采用正、負(fù)離子掃描模式[11],霧化氣和干燥氣為高純氮?dú)?噴霧氣壓力5 psi,干燥氣流速為4.0 L/min,干燥氣溫度為180 ℃,毛細(xì)管電壓為3000 V,掃描范圍為質(zhì)荷比50～1000 (m/z)。

1.2.4.2 核磁共振分析(NMR) 分別稱(chēng)取一定量化合物H1、H2、H3、H4、H5,使用氘帶甲醇進(jìn)行溶解[12],置于核磁管中,用AVANCE-III HD600超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行測(cè)定,以四甲基硅烷(TMS)作內(nèi)標(biāo),化學(xué)位移δ和偶合常數(shù)J分別采用ppm以及Hz表示,1H-NMR以及13C-NMR的工作頻率分別為600、151 MHz。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的粗分離結(jié)果

猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相經(jīng)梯度洗脫、等量逐份收集洗脫液、TLC顯色分析合并,以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)分別得到組分C1～C10,其中C1共7.68 g,C2共0.167 g,C3共1.2 g,C4共2.98 g,C5共3.18 g,C6共2.41 g,C7共1.28 g,C8共4.94 g,C9共2.88 g,C10共1.06 g。

其中組分C2為無(wú)色油狀物,經(jīng)TLC檢測(cè)分析為單一化合物,因此標(biāo)記為化合物H1(167 mg)。組分C6、組分C7以及組分C8經(jīng)HPLC分析,相對(duì)較易分離得到單一化合物,其他組分所含物質(zhì)種類(lèi)復(fù)雜,分離難度大,因此選擇組分C6、組分C7以及組分C8進(jìn)行后續(xù)分離純化。

2.2 猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相的細(xì)分離結(jié)果

2.2.1 組分C6的分離純化結(jié)果 組分C6經(jīng)梯度洗脫,得到4個(gè)組分C6-1、C6-2、C6-3和C6-4,經(jīng)TLC檢測(cè)分析,組分C6-2(0.915 g)可以得到有效分離,因此對(duì)組分C6-2進(jìn)一步采用半制備型HPLC進(jìn)行分離純化。

組分C6-2的半制備HPLC分離譜圖如圖1所示,根據(jù)HPLC分析結(jié)果,保留時(shí)間為35.011～39.538 min的化合物為單一化合物,因此對(duì)其進(jìn)行收集,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮30 min,得到無(wú)色針狀結(jié)晶,標(biāo)記為化合物H2(23.1 mg)。

圖1 組分C6-2的半制備HPLC分離譜圖Fig.1 The semi-preparative HPLCchromatogram for fraction C6-2

2.2.2 組分C7的分離純化結(jié)果 組分C7經(jīng)梯度洗脫,得到8個(gè)組分C7-1、C7-2、C7-3、C7-4、C7-5、C7-6、C7-7、C7-8,經(jīng)TLC檢測(cè)分析,組分C7-3(128 mg)可以得到有效分離,因此對(duì)組分C7-3進(jìn)一步采用硅膠柱層析進(jìn)行分離純化。

組分C7-3經(jīng)梯度洗脫,得到3個(gè)組分C7-3-1、C7-3-2和C7-3-3,其中,組分C7-3-1有白色鱗片狀結(jié)晶析出,用石油醚反復(fù)重結(jié)晶后得到白色鱗片狀結(jié)晶,經(jīng)TLC檢測(cè)分析為單一化合物,標(biāo)記為化合物H3(9.4 mg)。

2.2.3 組分C8的分離純化結(jié)果 組分C8的制備型HPLC分離譜圖如圖2所示,根據(jù)HPLC分析結(jié)果,保留時(shí)間分別為11.565～14.013 min以及17.576～21.581 min的化合物均為單一化合物,因此對(duì)這兩部分分別進(jìn)行收集,并在45 ℃條件下旋蒸濃縮30 min,分別得到白色針狀結(jié)晶(60.4 mg)以及無(wú)色片狀結(jié)晶(48.3 mg),分別標(biāo)記為化合物H4和化合物H5。

圖2 組分C8的半制備HPLC分離譜圖Fig.2 The semi-preparative HPLC chromatogram for fraction C8

2.3 化合物H1～H5的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 化合物H1的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物H1為無(wú)色油狀物,由質(zhì)譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=281[M-H]-,其分子量為282。

化合物H1的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ5.34(1H,t,J=4.7 Hz)為一個(gè)烯氫信號(hào),δ2.27(1H,t,J=7.4 Hz)可能為一個(gè)炔烴上的質(zhì)子信號(hào)或者與N、S、C=O、Ar相連的碳上的一個(gè)質(zhì)子信號(hào),δ2.05(1H,dd,J=12.7,6.3 Hz)為與雙鍵相連碳上的質(zhì)子信號(hào),δ1.61(2H,m),1.31(10H,d,J=17.0 Hz),0.94～0.86(2H,m)為飽和碳上的質(zhì)子信號(hào);化合物H1的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ176.29處的碳信號(hào)提示分子中含有一個(gè)羧基,δ129.46,127.69與1H-NMR譜中提供的雙鍵信息相對(duì)應(yīng),δ33.56,31.67,29.92～27.46,26.71,24.70,22.33,13.04。

據(jù)上述數(shù)據(jù)分析,并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜以及劉天行等[13]報(bào)道的油酸譜圖數(shù)據(jù)基本吻合,由此確定化合物H1為油酸(Oleic acid),分子式為C18H34O2,結(jié)構(gòu)式如圖3。

圖3 化合物H1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structure of compound H1

2.3.2 化合物H2的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物H2為無(wú)色針狀結(jié)晶,由質(zhì)譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=329[M-H]-,分子量為330。

化合物H2的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ6.89(s,1H)提示分子中存在芳香基團(tuán),δ6.13(1H,s)可能為一個(gè)雙鍵碳或者芳香基團(tuán)碳上的質(zhì)子信號(hào),δ3.88(3H,s)可能為-OCH3中的質(zhì)子信號(hào),δ2.83(1H,d,J=13.8 Hz),2.72(2H,t,J=6.7 Hz),2.63(1H,d,J=13.8 Hz),1.87(3H,m),1.86(3H,s)可能為飽和碳上或者三鍵碳上的質(zhì)子信號(hào),δ2.12(3H,d)可能為與三鍵或者雙鍵碳相連碳上的質(zhì)子信號(hào),δ1.4(3H,s)為飽和碳上的質(zhì)子信號(hào);化合物H2的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ198.94提示分子中存在烯丙氧基結(jié)構(gòu),δ172.6,158.74為羰基碳的信號(hào)特征,δ155.81,148.82,131.10,124.88,124.72,114.17,95.34為雙鍵碳信號(hào),δ75.82,68.27,54.93為-O-CH2中的碳信號(hào),δ51.52,30.51為飽和碳信號(hào),δ26.33,23.68,19.48,16.93為與雙鍵相鄰的碳信號(hào)。據(jù)上述數(shù)據(jù)分析,并與Ueda K等[14]報(bào)道的從猴頭菇中提取得到的異苯并呋喃酮衍生物Hericenone I的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合,由此確定化合物H2為Hericenone I,分子式為C19H22O5,結(jié)構(gòu)式如圖4。

Ma等[15]在對(duì)猴頭菇中具有細(xì)胞毒性的芳香化合物研究過(guò)程中,分離得到了Hericenone I,研究表明,Hericenone I對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性,在濃度為1×10-3mol/L時(shí),其對(duì)EC109細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為65.34%,這可能是因?yàn)槠渚哂信c霉酚酸相近的結(jié)構(gòu)。

圖4 化合物H2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structure of compound H2

2.3.3 化合物H3的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物H3為白色鱗片狀結(jié)晶,由質(zhì)譜譜圖得出ESI-MS(Positive mode):m/z=587[2M+Na]+,其分子量為282。

化合物H3的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ1.29(54H,s,27CH2),0.89(6H,t,J=4.45 Hz,2CH3)均為烷烴上的質(zhì)子信號(hào);化合物H3的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ31.67,29.07,22.34,13.04。

據(jù)上述數(shù)據(jù)分析,并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜以及Chen Z等[16]報(bào)道的正二十九烷的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合,由此確定化合物H3為正二十九烷(n-Nonacosane),分子式為C29H60,結(jié)構(gòu)式如圖5。

圖5 化合物H3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.5 Chemical structure of compound H3

陳宇[17]在對(duì)小刺猴頭菌的子實(shí)體和發(fā)酵液中的化學(xué)成分進(jìn)行分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)猴頭菇子實(shí)體中含有正二十九烷。與本研究結(jié)果一致。

2.3.4 化合物H4的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物H4為白色針狀結(jié)晶,由質(zhì)譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=243[M-H]-,其分子量為244。

化合物H4的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ8.00(1H,d,J=8.1 Hz)為一個(gè)烯氫信號(hào),δ5.90(1H,d,J=4.7 Hz),5.70(1H,d,J=8.1 Hz)可能為烯氫信號(hào)或者酰胺鍵中與N相連的質(zhì)子信號(hào),δ4.27(2H,d,J=7.7 Hz),4.26(1H,d,J=7.8 Hz),4.15(1H,s,J=5.1 Hz)可能為烯氫信號(hào)或者羥基上的質(zhì)子信號(hào),δ3.87(1H,dd,J=9.6,7.1 Hz),3.83(2H,d,J=12.3,2.4 Hz),3.75(3H,m)。化合物H4的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ164.79,151.09處的碳信號(hào)為羰基碳的信號(hào)特征,δ141.35,102.70,101.33為雙鍵碳信號(hào),與1H-NMR譜中的烯氫信號(hào)相對(duì)應(yīng),δ89.38,84.97,69.91,60.92為-O-CH2-中的碳信號(hào)。

據(jù)上述分析,并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜以及Mantsch H H等[18]報(bào)道的尿苷的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合,由此確定化合物H4為尿苷(Uridine),分子式為C9H12N2O6,結(jié)構(gòu)式如圖6。

圖6 化合物H4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structure of compound H4

尿苷是一種核苷,其具有治療多種疾病的潛在作用。張珂等[19]研究發(fā)現(xiàn),短期使用尿苷可以阻止一些藥物引起的脂肪肝,但長(zhǎng)期使用會(huì)加劇脂肪肝的形成。此外,尿苷還可作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體[20],具有極其重要的醫(yī)藥價(jià)值,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。

2.3.5 化合物H5的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物H5為無(wú)色片狀結(jié)晶,由質(zhì)譜譜圖得出ESI-MS(Negative mode):m/z=351[M+Cl]-,分子量為316。

化合物H5的1H-NMR譜數(shù)據(jù)(600 MHZ,CD3OD,TMS):δ7.96(1H,d,J=1.1 Hz),6.31(1H,d,J=16.6 Hz)為烯烴或者芳烴上的質(zhì)子信號(hào),δ5.57(s,2H),5.39(t,1H,J=7.2 Hz),5.25(t,1H,J=6.9 Hz)為烯氫信號(hào)指示,δ3.82(s,3H),δ3.46(d,2H,J=7.2 Hz)為與O或者鹵素相連飽和碳上的質(zhì)子信號(hào),δ2.34(m,2H)可能為一個(gè)炔烴上的質(zhì)子或者與N、S、C=O、-Ar相連的碳上的一個(gè)質(zhì)子信號(hào),δ1.93(m,2H),1.78(s,3H),1.62(s,3H),1.30(s,3H)為-C=C-CH或者-C≡C-CH質(zhì)子信號(hào);化合物H5的13C-NMR譜數(shù)據(jù)(151 MHZ,CD3OD,TMS):δ172.84,166.42為羰基碳的碳信號(hào),δ152.88,145.06,135.06,132.55,124.54,123.31,116.01,103.62,96.27為雙鍵碳信號(hào)特征,δ71.56,56.78為-O-CH2-中的碳信號(hào)特征,δ39.39,27.31,25.22,21.65,17.80,16.04。

據(jù)上述數(shù)據(jù)分析,并與Ueda K等[14]、Cordes J等[21]報(bào)道的從猴頭菇中提取得到的異苯并呋喃酮衍生物Hericenone J的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合,由此確定化合物H5為Hericenone J,其分子式為C19H24O4,結(jié)構(gòu)式如圖7。

Hericenone J為猴頭菇子實(shí)體的次生代謝產(chǎn)物,屬于異苯并呋喃酮衍生物,研究表明其具有一定的刺激內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)的活性[21]。

圖7 化合物H5的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.7 Chemical structure of compound H5

3 結(jié)論

猴頭菇中富含多種生物活性成分,從其子實(shí)體乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相中提出分離并鑒定出油酸、Hericenone I、正二十九烷、尿苷、Hericenone J。其中Hericenone I與Hericenone J為猴頭菇子實(shí)體的次生代謝產(chǎn)物,屬于異苯并呋喃酮衍生物,據(jù)報(bào)道它們均有一定的刺激內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)的活性[21],Hericenone I還被證實(shí)對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性[15],這可能是因?yàn)槠渚哂信c霉酚酸相近的結(jié)構(gòu),這些都顯示了其作為猴頭菇活性成分的功能活性及作為功能性食品開(kāi)發(fā)應(yīng)用的意義和潛力。尿苷是一種核苷,具有治療多種疾病的潛在作用,如可阻止脂肪肝[19]以及作為抗病毒抗腫瘤藥物的中間體[20],具有極其重要的醫(yī)藥價(jià)值。本文為猴頭菇活性成分的研究提供了理論依據(jù),對(duì)其開(kāi)發(fā)及應(yīng)用有重要意義。