梁貴江,曾茂茂,何志勇,秦 昉,陳 潔

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué)食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

大豆蛋白作為一種常見的植物性蛋白,因其營養(yǎng)價值很高,同時價格低廉,從而成為人類重要的營養(yǎng)來源和工業(yè)原料。它具有乳化性、起泡性、凝膠性、熱穩(wěn)定性等重要性質(zhì),可用來制造傳統(tǒng)食品及新型食品,使這些產(chǎn)品具有良好的組織結(jié)構(gòu)及外觀。植脂末是一種利用微膠囊技術(shù)將油脂用水溶性壁材包埋形成的粉末狀產(chǎn)品,其具有制作工藝簡單、穩(wěn)定性好、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于配方奶粉、固體飲料、冰淇淋等食品體系中。

大豆分離蛋白(SPI)的乳化性質(zhì)在許多食品中已有應(yīng)用,但與食品工業(yè)中常用的酪蛋白酸鈉相比,其乳化活性和乳化穩(wěn)定性與酪蛋白酸鈉相差甚遠(yuǎn)。提高大豆蛋白的乳化性,使其能夠在植脂末等體系中應(yīng)用,是大豆蛋白改造的一個熱點(diǎn)方向之一。大量研究發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)改造例如大豆蛋白組分分離、熱變性、有限水解等有利于提高大豆分離蛋白的乳化性[1-3]。報道顯示,7S蛋白的乳化性質(zhì)明顯好于11S蛋白[4],7S蛋白疏水性較大,分子量較小,形成的乳狀液比11S蛋白更加穩(wěn)定[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),熱處理過程中蛋白濃度、加熱溫度及時間對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有很大影響,當(dāng)熱處理溫度大于85 ℃時,大豆蛋白溶液經(jīng)過短時間熱處理后產(chǎn)物乳化性質(zhì)提高[7]。木瓜蛋白酶等酶處理對大豆蛋白進(jìn)行酶解,酶解產(chǎn)物的乳化能力和乳化穩(wěn)定性明顯提高[8]。胃蛋白酶由于在酸性條件下可以選擇性水解11S蛋白,保留高表面活性的7S,11S水解產(chǎn)物也具有一定的表面活性,這種組合被認(rèn)為有助于提高水解產(chǎn)物的乳化性[9]。然而,迄今為止,很少有人研究大豆分離蛋白和不同酶水解方式對其酶解產(chǎn)物乳化性以及在實(shí)際體系應(yīng)用中的效果。

本論文對比研究了大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的組成和乳化性,并探討了大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物分別制備植脂末產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)以及乳狀液穩(wěn)定性。旨在為食品工業(yè)開發(fā)低成本、乳化性好的植脂末產(chǎn)品提供一定的理論和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東北大豆 黑龍江慶美種業(yè)有限公司;胃蛋白酶(3000 U/mg)、木瓜蛋白酶(2000 U/mg)生工生物工程(上海)股份有限公司;30%聚丙稀酰胺溶液(29∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、Nile Blue、Nile Red和考馬斯亮藍(lán)R250 Sigma-Aldrich公司;正己烷、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、過硫酸銨、正己烷、無水乙醇、甲醇、冰乙酸和甘油 國藥化學(xué)試劑有限公司。

JZ7114型粉碎機(jī) 上海朝陽微電機(jī)廠;RW20D型攪拌器、IKAT18型高速乳化均質(zhì)機(jī) 德國IKA實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司;UV-2800H型紫外可見光分光光度計 尤尼柯(上海)有限公司;Avanti J-26 XP高速離心機(jī) 美國Beckman公司;LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;601超級恒溫水浴 江蘇金壇市新航儀器廠;Mini-PROTEAN 3 Cell凝膠電泳儀 美國 Bio-Rad公司;TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司;ATS AH-basic高壓均質(zhì)機(jī) 加拿大ATS公司;S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司;Nano-ZS動態(tài)光散射儀 英國 Malvern公司;B-290小型噴霧干燥機(jī) 瑞士步琦(Buchi)公司;掃描電子顯微鏡(SU1510型) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白(SPI)的制備 將大豆去皮、粉碎,在豆粉中加入3倍質(zhì)量的正己烷攪拌浸提2 h,抽濾后得到脫脂豆粉。根據(jù)Puppo等[10]的方法用脫脂豆粉制備大豆分離蛋白(SPI)。脫脂豆粉加入蒸餾水(1∶10,w/v),使用2 mol/L NaOH將分散體調(diào)節(jié)至pH8,在室溫下攪拌2 h,離心(10000×g,20 min)。用2 mol/L HCl將上清液調(diào)節(jié)至pH4.5靜置30 min并離心(3300×g,10 min)。將離心獲得的沉淀用蒸餾水(1∶5,v/v)復(fù)溶,并用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH7.0,冷凍干燥即為大豆分離蛋白。

1.2.2 大豆分離蛋白(SPI)水解產(chǎn)物的制備 參照李偉偉[11]的方法,將大豆分離蛋白(SPI)溶于水,溶液濃度調(diào)節(jié)至7%(w/v),用2 mol/L HCl將SPI溶液調(diào)節(jié)至pH2.0,并在37 ℃下保溫30 min。然后,將0.8%(w/w)的胃蛋白酶加入到溶液中,開始酶水解反應(yīng),在37 ℃下酶解3 h。通過用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0來終止反應(yīng),120 ℃加熱20 s滅酶滅菌,冷卻后用3300×g離心10 min,收集上清液即為水解產(chǎn)物,該產(chǎn)物用HPE表示。

將大豆分離蛋白(SPI)溶于水,溶液濃度調(diào)節(jié)至7%(w/v),調(diào)節(jié) pH7.0,并在55 ℃下保溫30 min,然后加入0.5%(w/w)木瓜蛋白酶,進(jìn)行酶反應(yīng),反應(yīng)過程中利用0.2 mol/L的 NaOH 溶液滴定來控制pH至7,酶解1 h后,沸水浴加熱10 min終止反應(yīng),冷卻后3300×g離心10 min,收集上清液即為水解產(chǎn)物,該產(chǎn)物用PA表示。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 根據(jù)Liu等[12]的方法測定蛋白樣品(SPI、HPE、PA)的電泳亞基組成,其中濃縮膠濃度4%,分離膠濃度12%,pH8.0 樣品緩沖液,含有0.01 mol/L Tris-HCl,2% SDS,10%甘油和0.02%溴酚藍(lán)。調(diào)節(jié)蛋白樣品濃度為2 mg/mL,與等體積樣品緩沖液混合,沸水浴加熱3 min,冷卻,上樣量20 μL至上樣槽,電泳結(jié)束后取出凝膠染色并脫色,用凝膠成像儀拍攝圖片,并做電泳條帶掃描分析。

1.2.4 分子量分布測定 參照He等[13]的方法,用高效液相色譜法來測定蛋白樣品(SPI、HPE、PA)的分子量分布,使用KW-804蛋白凝膠柱(排阻極限106Da)和紫外檢測器(檢測波長280 nm)。流動相是0.05 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液(含0.3 mol/L的NaCl),洗脫速率為1 mL/min。細(xì)胞色素c(12 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、白蛋白(66 kDa)、醇脫氫酶(150 kDa)、淀粉酶(200 kDa)和甲狀腺球蛋白(669 kDa)作為分子量標(biāo)記用于校準(zhǔn)曲線。樣品濃度均為10 mg/mL,取10 μL進(jìn)樣分析。以出峰時間為橫坐標(biāo),分子量取對數(shù)為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-0.4708x+6.6162,R2=0.9856。

1.2.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定 乳狀液的制備 用待測樣品蛋白(SPI、HPE、PA)濃度調(diào)節(jié)為5 mg/mL,再與大豆油以4∶1體積混合,用分散器13500 r/min分散2 min。在離燒杯底部0.5 cm處取20 μL新鮮制備的乳狀液,加入到5 mL 0.1% SDS溶液中,混合均勻后在500 nm處測定吸光值,記為A0,乳狀液靜置30 min后采用相同的方法測定吸光值,記為A30,用0.1% SDS溶液作空白對照。根據(jù)Molina和Guo等人[14-15]的方法,乳化活性指標(biāo)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指標(biāo)(ESI)按照如下公式進(jìn)行計算:

EAI(m2/g)=(2×T×A0×N)/[c×Φ×104];

ESI(%)=A30/A0×100

其中,T=2.303,N為稀釋倍數(shù),c為乳狀液形成前蛋白質(zhì)的濃度(g/mL),Φ為乳狀液中油相的體積分?jǐn)?shù),Φ=25%。

1.2.6 植脂末的制備 主要原料為SPI、HPE、PA、氫化椰子油、葡萄糖漿和水。其中,蛋白含量8%(w/w),油脂含量為30%(w/w),葡萄糖含量為22%(w/w),純水含量40%(w/w)。用分散器13500 r/min分散2 min,再經(jīng)過高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)兩遍,均質(zhì)壓力為30 MPa,最后進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥條件:進(jìn)口溫度180～200 ℃,出口溫度90～95 ℃。

表1 大豆分離蛋白及其水解產(chǎn)物分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of SPI and its hydrolysates

1.2.7 掃描電子顯微鏡 參照李偉偉[11]的方法,利用掃描電子顯微鏡觀察植脂末粉末的微觀結(jié)構(gòu),通過對顆粒的形狀、分布進(jìn)行分析,加速電壓為5 kV,放大倍數(shù)1200倍。

1.2.8 共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM) 將制好的植脂末復(fù)溶于60 ℃的熱水,配制2%(w/v)植脂末溶液,參照Zhang等人[16]的方法,將20 μL熒光染料(0.1% Nile Blue,0.01% Nile Red,乙醇配制)加入到 5 mL的植脂末溶液中,取10 μL乳狀液滴到載玻片上,蓋上蓋玻片,指甲油密封,避光保存,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察乳狀液的微觀結(jié)構(gòu),激發(fā)波長為633 nm。

1.2.9 平均粒徑和ζ-電位的測定 參照程宇[17]的方法,將制好的植脂末復(fù)溶于60 ℃的熱水,配制2%(w/v)植脂末溶液,樣品用10 mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋到濃度為0.001 wt%,采用激光粒度分析儀的Bluewave模式和馬爾文Nano ZS型動態(tài)光散射儀的SOP模式分別測定樣品的平均粒徑和ζ-電位。

1.2.10 咖啡穩(wěn)定性測試 將制好的植脂末粉末加入到200 mL的1%濃度的咖啡溶液中,其中混合溫度為75 ℃,植脂末粉末與咖啡粉的比例為1∶2,分別觀察0 h和放置24 h后的咖啡溶液的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個樣品設(shè)三個重復(fù),采用Statistix 9.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的亞基組成

圖1為大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物亞基的組成。7S蛋白主要由α′,α和β三種亞基組成,11S蛋白主要由酸性亞基A和堿性亞基B組成。從電泳圖可以看出,原始大豆蛋白大分子聚集體含量比較高,AB亞基聚集體含量也比較高;胃蛋白酶優(yōu)先水解11S蛋白,胃蛋白酶水解產(chǎn)物中保留更多7S蛋白,同時產(chǎn)物中還保留了部分堿性亞基;木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物主要為小部分堿性亞基條帶和大量的小分子肽。

圖1 大豆分離蛋白及其水解產(chǎn)物亞基組成的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE patterns ofSPI and its hydrolysates subunits注:MW:分子量標(biāo)記(Da);α′(86 kDa),α(66 kDa)和β(51 kDa);A,酸性亞基(34～43 kDa),B,堿性亞基(17～26 kDa)。

2.2 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的分子量分布

表1表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的分子量分布。分子量分布與電泳結(jié)果比較吻合,SPI有少量聚集體,大部分的分子量集中在100～669 kDa,這個區(qū)間分布的主要是7S蛋白和11S蛋白。HPE只剩下7S蛋白,堿性亞基和小分子多肽,分子量主要集中在100～669 kDa和小于10 kDa。PA只剩下小部分堿性亞基和大量的小分子肽,分子量大部分集中在10 kDa以下區(qū)間。

2.3 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

圖2表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。從圖2可知,HPE的乳化性質(zhì)均比SPI有顯著提高(P<0.05),乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別提高了22.7%和14.1%,而PA的乳化活性大幅度提高,但乳化穩(wěn)定性顯著低于SPI(P<0.05),乳化穩(wěn)定性下降了17.6%。SPI的乳化活性較差,這是可能由于SPI中11S蛋白是由二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基而成的六聚體[18],結(jié)構(gòu)緊湊,分子量較大,蛋白分子靈活性和表面疏水性較低,蛋白分子吸附到水-油界面上的速度慢,降低界面張力的能力弱。蛋白吸附到油-水界面的速度越快,并在界面上展開、重排和暴露疏水集團(tuán)的能力越大,乳化活性就越強(qiáng),乳化穩(wěn)定性則與蛋白能否在油滴外圍形成強(qiáng)度較大的剛性結(jié)構(gòu)有關(guān)[19]。HPE乳化活性大幅度提高可能是由于其組成主要7S和堿性亞基,11S被水解后,蛋白的緊密結(jié)構(gòu)展開、分解,促使疏水性基團(tuán)的暴露,增加小分子量多肽,提高了分子靈活性,蛋白質(zhì)分子能更迅速轉(zhuǎn)移至油-水界面,有效降低表面張力,且大量存在的7S蛋白和堿性亞基可以在油滴外圍形成高強(qiáng)度的剛性結(jié)構(gòu),有利于乳化穩(wěn)定性的提高。PA的7S和11S蛋白都水解后,水解會釋放出疏水基團(tuán),增加蛋白疏水性,有利于乳化性的提高,但由于小分子肽含量過多,分子量過小的蛋白在油-水界面無法形成剛性結(jié)構(gòu),所以乳化穩(wěn)定性較差,形成的乳狀液不穩(wěn)定[20]。

圖2 大豆分離蛋白及其水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.2 Emulsifying activity and emulsionstability of SPI and its hydrolysates注：對于同一測定指標(biāo)，不同字母表示差異顯著(P<..05)。

2.4 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物對植脂末粉末及植脂末復(fù)水后乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖3表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物對植脂末粉末微觀結(jié)構(gòu)的影響。從圖3可以看出,SPI和PA制備的植脂末顆粒粘結(jié)聚集現(xiàn)象較嚴(yán)重,而用HPE制備的植脂末顆粒都是球形,壁材完整,基本沒有粘結(jié)聚集現(xiàn)象發(fā)生,顆粒分布較為均勻,這將有利于粉末在水中進(jìn)行分散。

圖3 植脂末粉末的掃描電子顯微鏡圖Fig.3 SEM pattern of non-dairy creamer powder注:(a)SPI;(b)HPE;(c)PA。放大倍數(shù)1500倍。

圖4表示大豆分離蛋白不同酶法水解產(chǎn)物對植脂末復(fù)水后乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響。從圖4可以看出,SPI形成的乳狀液粒徑較大,且容易發(fā)生絮凝和液滴聚集,這與Chen等報道的類似[21]。HPE形成的乳狀液液滴很小,且分布均勻,沒有發(fā)生絮凝,這與其很好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性非常吻合。PA形成的乳狀液液滴雖然有少量的聚集,但優(yōu)于SPI形成的乳狀液,這也與PA乳化活性優(yōu)于SPI但不如HPE的性質(zhì)相吻合。

圖4 復(fù)水乳液的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.4 CLSM pattern of emulsion after rehydration emulsion注:(A)SPI;(B)HPE;(C)PA。

圖5 復(fù)水乳液的平均粒徑和ζ-電位Fig.5 Average particle size andζ-potential of rehydration emulsion注:對于同一測定指標(biāo),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物對植脂末復(fù)水后乳液的平均粒徑和ζ-電位的影響

圖5表示大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物對植脂末復(fù)水后乳液的平均粒徑和ζ-電位的影響。將制成的植脂末溶液放置0 h和6 h分別測量乳狀液平均粒徑的變化,復(fù)水后乳液HPE的平均粒徑最小(SPI>PA>HPE),且6 h后的平均粒徑幾乎無變化,說明形成的乳狀液很穩(wěn)定。而SPI和PA的乳狀液粒徑6 h后變化較大,說明乳狀液穩(wěn)定性較差。復(fù)水乳液0 h和6 h后HPE的ζ-電位絕對值最大(HPE>PA>SPI),ζ-電位絕對值越高,粒子間排斥力越大,乳狀液體系穩(wěn)定性越高[22],ζ電位結(jié)果也進(jìn)一步說明HPE形成的乳狀液最穩(wěn)定。

2.6 大豆分離蛋白及其不同酶法水解產(chǎn)物制備的植脂末對咖啡穩(wěn)定性影響

圖6表示大豆分離蛋白及其不同酶法酶解物制備的植脂末對咖啡穩(wěn)定性影響。將不同酶法水解產(chǎn)物制備的植脂末加入熱咖啡中,24 h后SPI最上層出現(xiàn)少量白色懸浮物,而HPE和PA呈現(xiàn)穩(wěn)定的均一狀態(tài),上述結(jié)果暗示,兩種酶解物可以有效提高產(chǎn)物乳化活性,未來可用于液態(tài)或者粉末態(tài)咖啡伴侶等體系的應(yīng)用。

圖6 植脂末加入咖啡中的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of adding non-dairy cream to coffee注:從左到右依次是SPI,HPE,PA。

3 結(jié)論

SPI胃蛋白酶水解產(chǎn)物中含有較多7S蛋白和小分子多肽,乳化活性和乳化穩(wěn)定性比SPI均有顯著提高;而木瓜蛋白酶水解物含有少量堿性亞基和大量小分子多肽,乳化活性比SPI顯著提高但乳化穩(wěn)定性顯著下降;制備的植脂末微觀結(jié)構(gòu)和植脂末溶解后乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)也進(jìn)一步證實(shí)了SPI胃蛋白酶水解產(chǎn)物制備的產(chǎn)品具有最好的乳化效果,咖啡穩(wěn)定性結(jié)果顯示,兩種酶解物均可用于咖啡伴侶。如果酶解物中存在過多小分子肽,盡管分子柔性增加有利于界面快速成膜從而提高乳化活性,但由于難以形成剛性膜、界面膜強(qiáng)度不足,會不利于乳化穩(wěn)定性;如果能夠保留相對較多的7S蛋白和堿性亞基,則有助于形成更高強(qiáng)度的界面膜,從而使得乳化活性和乳化穩(wěn)定性同步提高,從而有利于乳狀液更加穩(wěn)定。本研究為大豆蛋白在植脂末產(chǎn)品以及其他高乳化性需求產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。