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        大麻二醇對(duì)高糖條件下視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響及機(jī)制

        2019-11-27 08:54:58張嬋譚鋼
        中國(guó)社區(qū)醫(yī)師 2019年30期

        張嬋 譚鋼

        421001南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科1,湖南 衡陽(yáng)

        417000湖南省婁底市愛(ài)爾眼科2,湖南 婁底

        糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,也是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因。血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是DR發(fā)生的重要病理生理改變,包括毛細(xì)血管基底膜增厚,內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞丟失,視網(wǎng)膜屏障受損和滲漏,以及新生血管化[1]。在視網(wǎng)膜血管生成的生長(zhǎng)因子中,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被認(rèn)為是主要的介導(dǎo)因子[2]。大麻二醇(CBD)是從大麻中提取出來(lái)的一種植物大麻素?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,CBD在癌癥、糖尿病、炎癥和神經(jīng)退行性疾病方面具有一定療效,并且對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病和血-視網(wǎng)膜屏障具有保護(hù)作用。本研究旨在觀察CBD對(duì)HRCECs增殖及VEGF 表達(dá)的影響,并初步探索VEGF可能的調(diào)控機(jī)制。

        資料與方法

        細(xì)胞培養(yǎng)與處理:HRCECs 于含10%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為6 組:P0組(空白對(duì)照):僅加入等體培養(yǎng)基;P1組(溶劑對(duì)照組):加入0.5%乙醇作為溶劑對(duì)照;P2組(低糖對(duì)照組)+0.5%乙醇:葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L+0.5%乙醇;P3組(高糖對(duì)照組):葡萄糖濃度為22 mmol/L+0.5%乙醇;P4組:P3+1 μ mol/L 大 麻 二 醇(CBD);P5組:P3+10 μmol/LCBD。

        細(xì)胞增殖分析:將0.5%MTT溶液分別加入各孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,吸出上清液,每孔加入150 μL DMSO 溶解,置搖床上使結(jié)晶溶解完,上機(jī)檢測(cè),490 nm 波長(zhǎng),測(cè)定各孔吸光度(A)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算細(xì)胞活力。

        實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)VEGF mRNA 表達(dá):使用TRIzol 試劑提取總RNA,在20 μL反應(yīng)中使用1 μg總RNA和隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),設(shè)計(jì)人VEGF 基因的引物,在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行PCR。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法,通過(guò)計(jì)算其與管家基因β-actin的比值確定相對(duì)基因表達(dá)水平。

        Western blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)及FOXO3a 磷酸化:用裂解緩沖液在4℃下裂解60 min 以提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12% SDS-PAGE 處理后,電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上,經(jīng)封閉后,加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜,充分洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h。最后采用化學(xué)發(fā)光法顯影并檢測(cè)信號(hào)。

        結(jié) 果

        大麻二醇對(duì)高糖條件下HRCECs 增殖的影響:MTT 結(jié)果顯示,在相同的時(shí)間點(diǎn),高糖組細(xì)胞增殖率明顯高于低糖組,并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞活性逐漸增高;而分別加入1 μmol/L 和10 μ mol/L CBD 處理后,與高糖組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且隨著CBD濃度的升高,細(xì)胞活性有所降低。

        大麻二醇對(duì)體外培養(yǎng)的HRCECs 中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響:實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示,對(duì)P1溶劑對(duì)照組和P2低糖組細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)無(wú)明顯影響,而P3高糖組VEGF mRNA 表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予CBD 處理后,P4和P5組VEGF 表達(dá)水平明顯降低。此外,Western blot 結(jié)果也顯示,VEGF 蛋白表達(dá)水平與mRNA 類似。見(jiàn)圖1。

        圖1 CBD對(duì)高糖條件下HRCECs中VEGF蛋白表的影響

        大麻二醇對(duì)體外培養(yǎng)的HRCECs 中FOXO3a 磷酸化影響:Western blot 結(jié)果顯示,P0空白組和P1溶劑對(duì)照組組細(xì)胞中FOXO3a 第253 位絲氨酸(Ser253)磷 酸化水平較低,P2低糖組和P3高糖組均有不同程度的增高。而加入1 μmol/L 和10 μmol/L CBD后,Ser253磷酸化水平隨之減少。

        討 論

        本研究采用MTT 法觀察了高糖(22 mmol/L)和低糖環(huán)境下(5.5 mmol/L)HRCECs 的增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對(duì)HRCECs 的增殖具有促進(jìn)作用,與相關(guān)報(bào)道相符。VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的中心環(huán)節(jié)。既然高糖環(huán)境能促進(jìn)HRCECs 增殖并上調(diào)VEGF 表達(dá),那么可以通過(guò)干預(yù)VEGF 過(guò)度表達(dá)的方式間接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,從而達(dá)到延緩PDR 的目的[3]。本研究采用高低兩種劑量的CBD 作用高糖條件下的HRCECs,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活性受到抑制。實(shí)時(shí)定量PCR 和Western blot 結(jié)果顯示,CBD 處理也能下調(diào)VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)水平,說(shuō)明土槿乙酸抑制體外HRCECs的增殖可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)。FOX 蛋白是廣泛參與細(xì)胞增殖分化的一類轉(zhuǎn)錄因子,其中以FOXO3a 最重要。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組中Ser253 磷酸化水平較低,高糖條件下Ser253 磷酸化水平明顯增高。但給予CBD 孵育后,Ser253 磷酸化水平明顯減少。總之,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CBD 能夠抑制高糖培養(yǎng)條件下HRCECs 的增殖,并能抑制VEGF 的表達(dá),其機(jī)制可能與激活核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a 的活性有關(guān)。但本研究?jī)H僅為體外實(shí)驗(yàn),并且只考慮了VEGF,事實(shí)上PDR 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多種發(fā)病機(jī)制相互影響,加之VEGF受多重信號(hào)通路調(diào)控,因此以上一系列問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。

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