張嬋 譚鋼

421001南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科1，湖南 衡陽(yáng)

417000湖南省婁底市愛(ài)爾眼科2，湖南 婁底

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因。血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是DR發(fā)生的重要病理生理改變，包括毛細(xì)血管基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞丟失，視網(wǎng)膜屏障受損和滲漏，以及新生血管化[1]。在視網(wǎng)膜血管生成的生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被認(rèn)為是主要的介導(dǎo)因子[2]。大麻二醇(CBD)是從大麻中提取出來(lái)的一種植物大麻素?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，CBD在癌癥、糖尿病、炎癥和神經(jīng)退行性疾病方面具有一定療效，并且對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病和血-視網(wǎng)膜屏障具有保護(hù)作用。本研究旨在觀察CBD對(duì)HRCECs增殖及VEGF 表達(dá)的影響，并初步探索VEGF可能的調(diào)控機(jī)制。

資料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)與處理：HRCECs 于含10%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為6 組：P0組(空白對(duì)照)：僅加入等體培養(yǎng)基；P1組(溶劑對(duì)照組)：加入0.5%乙醇作為溶劑對(duì)照；P2組(低糖對(duì)照組)+0.5%乙醇：葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L+0.5%乙醇；P3組(高糖對(duì)照組)：葡萄糖濃度為22 mmol/L+0.5%乙醇；P4組：P3+1 μ mol/L 大 麻 二 醇(CBD)；P5組：P3+10 μmol/LCBD。

細(xì)胞增殖分析：將0.5%MTT溶液分別加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶解，置搖床上使結(jié)晶溶解完，上機(jī)檢測(cè)，490 nm 波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞活力。

實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)VEGF mRNA 表達(dá)：使用TRIzol 試劑提取總RNA，在20 μL反應(yīng)中使用1 μg總RNA和隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)計(jì)人VEGF 基因的引物，在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行PCR。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法，通過(guò)計(jì)算其與管家基因β-actin的比值確定相對(duì)基因表達(dá)水平。

Western blot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)及FOXO3a 磷酸化：用裂解緩沖液在4℃下裂解60 min 以提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12% SDS-PAGE 處理后，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，充分洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5 h。最后采用化學(xué)發(fā)光法顯影并檢測(cè)信號(hào)。

結(jié) 果

大麻二醇對(duì)高糖條件下HRCECs 增殖的影響：MTT 結(jié)果顯示，在相同的時(shí)間點(diǎn)，高糖組細(xì)胞增殖率明顯高于低糖組，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性逐漸增高；而分別加入1 μmol/L 和10 μ mol/L CBD 處理后，與高糖組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；且隨著CBD濃度的升高，細(xì)胞活性有所降低。

大麻二醇對(duì)體外培養(yǎng)的HRCECs 中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響：實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，對(duì)P1溶劑對(duì)照組和P2低糖組細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)無(wú)明顯影響，而P3高糖組VEGF mRNA 表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給予CBD 處理后，P4和P5組VEGF 表達(dá)水平明顯降低。此外，Western blot 結(jié)果也顯示，VEGF 蛋白表達(dá)水平與mRNA 類似。見(jiàn)圖1。

圖1 CBD對(duì)高糖條件下HRCECs中VEGF蛋白表的影響

大麻二醇對(duì)體外培養(yǎng)的HRCECs 中FOXO3a 磷酸化影響：Western blot 結(jié)果顯示，P0空白組和P1溶劑對(duì)照組組細(xì)胞中FOXO3a 第253 位絲氨酸(Ser253)磷 酸化水平較低，P2低糖組和P3高糖組均有不同程度的增高。而加入1 μmol/L 和10 μmol/L CBD后，Ser253磷酸化水平隨之減少。

討 論

本研究采用MTT 法觀察了高糖(22 mmol/L)和低糖環(huán)境下(5.5 mmol/L)HRCECs 的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對(duì)HRCECs 的增殖具有促進(jìn)作用，與相關(guān)報(bào)道相符。VEGF 是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的中心環(huán)節(jié)。既然高糖環(huán)境能促進(jìn)HRCECs 增殖并上調(diào)VEGF 表達(dá)，那么可以通過(guò)干預(yù)VEGF 過(guò)度表達(dá)的方式間接抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而達(dá)到延緩PDR 的目的[3]。本研究采用高低兩種劑量的CBD 作用高糖條件下的HRCECs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活性受到抑制。實(shí)時(shí)定量PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，CBD 處理也能下調(diào)VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，說(shuō)明土槿乙酸抑制體外HRCECs的增殖可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)。FOX 蛋白是廣泛參與細(xì)胞增殖分化的一類轉(zhuǎn)錄因子，其中以FOXO3a 最重要。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中Ser253 磷酸化水平較低，高糖條件下Ser253 磷酸化水平明顯增高。但給予CBD 孵育后，Ser253 磷酸化水平明顯減少。總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CBD 能夠抑制高糖培養(yǎng)條件下HRCECs 的增殖，并能抑制VEGF 的表達(dá)，其機(jī)制可能與激活核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a 的活性有關(guān)。但本研究?jī)H僅為體外實(shí)驗(yàn)，并且只考慮了VEGF，事實(shí)上PDR 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種發(fā)病機(jī)制相互影響，加之VEGF受多重信號(hào)通路調(diào)控，因此以上一系列問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。