郝大林 孫成學(xué) 肖福斌 鄧放

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院 1感染肝病科，吉林 吉林 132011； 2肝膽胰外科)

手術(shù)治療是首選的肝癌治療方案，但由于肝癌的早期病變惡性程度高、發(fā)病隱匿、診斷率低，使得很多患者喪失了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)〔1〕。因此，研究肝癌的其他有效治療手段是當(dāng)務(wù)之急。組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑(HDACI)亞甲酰胺異羥肟酸(SAHA)和索拉非尼(SRFN)是臨床上常用的治療肝癌的藥物，主要用于一些無(wú)法通過(guò)手術(shù)治療的肝癌患者〔2〕。聯(lián)合應(yīng)用SAHA和SRFN可以提高療效，減少毒副作用，達(dá)到綜合治療肝細(xì)胞癌(HCC)的效果〔3〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討SAHA與SRFN協(xié)同作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HepG2 細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù))放置于 37℃、二氧化碳濃度為5%的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的組成成分為含 10%滅活小牛血清的 RPMI1640 及含 1%的青霉素與鏈霉素雙抗。細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞，傳代頻率為2～3 d/次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為研究樣本。分為對(duì)照組(未處理)、SAHA(1.5 μmol/L SAHA處理)、SRFN(1.5 μmol/L SRFN處理)和SAHA聯(lián)合SRFN組(1.5 μmol/L SAHA和1.5 μmol/L SAHA處理)。

1.2劃痕法檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將5×105個(gè)細(xì)胞懸液均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用上述藥物處理24 h后，垂直使用10 μl的吸管尖端，產(chǎn)生細(xì)胞單層的劃痕。棄去舊培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，去除劃痕細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度及細(xì)胞密度比較一致的部分做標(biāo)記，分別在不同時(shí)間點(diǎn)拍照測(cè)量劃痕寬度并觀察劃痕的愈合速度。

1.3Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移 將無(wú)胎牛血清(FBS)的DMEM(1∶3)以60 μl/室加入Transwells頂腔，常溫放置2 h，在無(wú)血清DMEM中培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞24 h，制成密度為1×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。將200 μl的細(xì)胞懸浮液加入Matlab涂覆的頂層室中。將插入物放入含有500 μl DMEM、10%FBS的24孔板的底部室孔中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞固定在4%甲醛中15 min，然后用0.25%的結(jié)晶紫染色25 min，在空氣干燥前用無(wú)菌水沖洗插入物。無(wú)菌工作臺(tái)空氣干燥后，拍攝細(xì)胞膜，測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4Western印跡檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中蛋白水平 用SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN處理后，以細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取HepG2細(xì)胞的總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白(100 μg)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。硝酸纖維素膜依次經(jīng)過(guò)封閉、一抗孵育、洗膜、辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育、洗膜，最后采用化學(xué)發(fā)光顯色試劑顯影并攝像。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA聯(lián)合SRFN組侵襲能力分別為69.0%、47.8%和15.0%，見圖1。

圖1 各組HepG2細(xì)胞侵襲(×10)

2.2SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組(100.0%)相比，SAHA、SRFN、SAHA聯(lián)合SRFN組遷移能力分別為56.0%、47.0%和3.5%，處理不同時(shí)間的劃痕試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 各組不同處理時(shí)間HepG2細(xì)胞遷移(×10)

2.3SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對(duì)HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，SAHA或SRFN顯著上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)(P<0.05)。SAHA聯(lián)合SRFN組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著高于SAHA或SRFN組(P<0.05)。SAHA或SRFN顯著下調(diào)MMP-2、Vimentin的表達(dá)(P<0.05)，而對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。SAHA聯(lián)合SRFN組MMP-2和Vimentin的表達(dá)顯著低于SAHA或SRFN組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

HDACI通過(guò)抑制HDAC活性、調(diào)節(jié)組蛋白乙?；癄顟B(tài)、促進(jìn)抗腫瘤轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)〔4〕。SAHA是最具代表性的HDACI之一，它通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞核酸、染色質(zhì)的組蛋白乙酰化狀態(tài)，進(jìn)而抑制其增殖、分化功能發(fā)揮作用。研究顯示，SAHA通過(guò)調(diào)節(jié)基因，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)其他化療的敏感性，達(dá)到治療癌癥的目的〔3〕。盡管SAHA和SRFN的作用靶點(diǎn)不同，但腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和遷移受DNA調(diào)控，說(shuō)明兩者聯(lián)合可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。SAHA聯(lián)合SRFN對(duì)HepG2遷移和侵襲的抑制作用明顯強(qiáng)于SAHA和SRFN。Cha等〔5〕研究不同抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)不同，但均通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和改變腫瘤組織內(nèi)環(huán)境而顯示出抗腫瘤活性。細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡間有重要聯(lián)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)SAHA聯(lián)合SRFN對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移的抑制作用比SAHA和SRFN單獨(dú)作用要強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力在促進(jìn)原發(fā)腫瘤疾病進(jìn)展中起著重要作用，而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力是抗腫瘤藥物抑制腫瘤疾病進(jìn)展的重要方面。腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可增強(qiáng)其侵襲和遷移能力，可導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步惡化〔6〕。MMP-2、MMP-9、vimentin和E-cadherin是EMT的重要標(biāo)志蛋白〔7〕。MMP-2和MMP-9蛋白是MMP家族的兩個(gè)重要成員，另有研究表明MMP是EMT過(guò)程中最重要的蛋白水解酶。MMP-2和MMP-9在肺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程中表達(dá)顯著上調(diào)，與肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力有關(guān)〔8〕，Yang等〔9〕還發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達(dá)與肝癌細(xì)胞遷移能力呈正相關(guān)。然而，vimentin蛋白被認(rèn)為是EMT過(guò)程中發(fā)揮作用的一個(gè)重要蛋白。Ulirsch等〔10〕發(fā)現(xiàn)vimentin蛋白能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。E-cadherin在腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程中與MMPs和波形蛋白有相反的作用。E-cadherin是EMT過(guò)程中的一種上皮性標(biāo)志物，可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)表明腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于SAHA和SRFN的表達(dá)，SAHA聯(lián)合SRFN顯著下調(diào)MMP-2和vimentin蛋白的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin蛋白，表明這是SAHA和SRFN聯(lián)合用藥抗侵襲和遷移的分子機(jī)制。同時(shí)，SAHA和SRFN之間存在協(xié)同和疊加效應(yīng)。