李玉山 孫建明 李菊蘭

(1武威市中醫(yī)院，甘肅 武威 733000；2武威市涼州區(qū)西關街社區(qū)衛(wèi)生服務中心)

結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程復雜，涉及基因表達過度、基因突變等〔1，2〕。B細胞受體相關蛋白(BAP)31基因定位于Xq28，屬于BAP家族成員之一，在1994年被首次鑒定，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不可缺少的跨膜蛋白，在進化上保守，且在各個組織表達廣泛，以往研究發(fā)現(xiàn)，BAP31可介導小細胞小泡蛋白、主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅰ等分子離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以囊泡形式向其他細胞器運輸〔3〕；也可參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)〔4〕。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，不同組織中BAP31表達水平并不相同，在人體正常組織低表達或不表達(除睪丸組織外)，大多數(shù)惡性黑色素瘤BAP31高表達，可能是該病免疫治療的靶點〔5〕。結直腸癌細胞中BAP31表達明顯高于結腸上皮細胞，miR-451a調(diào)控BAP31誘導結直腸癌細胞凋亡〔6〕。BAP31對結直腸癌細胞增殖侵襲的影響及機制研究的尚未明確。本研究通過RNA干擾技術抑制結直腸癌細胞BAP31表達，觀察細胞的增殖及侵襲能力，并進一步研究其作用機制。

1 材料方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco；細胞計數(shù)試劑盒(CCK)8試劑盒購自日本同仁公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Transwell侵襲小室購自美國Corning公司；BAP31、β-catenin、增殖細胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自美國Abcam；LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen；酶標儀購自美國Thermo。

1.2細胞及培養(yǎng) 正常結腸上皮細胞NCM460及結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞均購自美國ATCC。細胞在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.3Western印跡 RIPA裂解液適量提取細胞總蛋白，BCA法測定樣品蛋白濃度，每孔30 μg上樣蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白分離后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%的脫脂奶粉封閉轉好的膜1 h，洗膜，加BAP31、β-catenin、PCNA、MMP-2和內(nèi)參GAPDH抗體(皆為1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育過夜，洗膜，加已配置好的1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，顯影、定影。以目的蛋白與GAPDH灰度值比值為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4siRNA轉染 根據(jù)GeneBank中提供的BAP31基因的cDNA序列，依據(jù)siRNA設計原則，設計針對BAP31的特異性siRNA及陰性對照siRNA，分別命名為si-BAP31組和NC組，由上海吉瑪合成純化。轉染前1 d接種 HCT116細胞于6孔板，密度為1×105個/孔，觀察到細胞生長融合達80%～90%時，參照LipofectamineTM2000說明，制備siRNA-Lip2000混合物，并將混合物加入至6孔板，同時設置空白對照組，僅加入脂質(zhì)體，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～6 h，更換為含血清及抗生素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞，用于后續(xù)實驗研究。

1.5CCK8法檢測細胞活力 取生長至對數(shù)期的HCT116細胞，胰酶消化后以5×103個/孔接種于96孔板，每孔200 μl，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h，轉染si-BAP31和NC，并設置空白對照組，每組設置5個復孔，分別收集轉染后24、48和72 h的細胞，加入CCK8試劑，每孔10 μl，37℃孵箱1.5 h后于450 nm處使用酶標儀測定吸光度值(A值)。實驗重復3次。

1.6Transwell小室檢測細胞侵襲能力 Matrigel膠鋪在Transwell小室的上室面，室溫風干。取生長至對數(shù)期的HCT116細胞，參照1.4分組及轉染方法制備成不含血清的單細胞懸液100 μl(約1×105個細胞)，加入到Transwell小室的上室內(nèi)，下室加入含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)液600 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，48 h后，取出小室，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%的結晶紫染色20 min，棉簽輕輕擦拭干凈小室內(nèi)的細胞，隨機選擇5個視野，倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數(shù)，取均值，實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1BAP31在結直腸癌細胞表達 以正常結腸上皮細胞NCM460為對照細胞，Western印跡檢測結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞中BAP31的蛋白表達(0.232±0.025、0.316±0.030、0.278±0.029、0.488±0.051)均顯著高于在NCM460細胞的表達(0.078±0.008，P<0.05)。見圖1。

圖1 BAP31在結直腸癌細胞表達

2.2si-BAP31轉染HCT116細胞效果 si-BAP31組BAP31表達(0.108±0.011)顯著低于空白對照組(0.658±0.052，P<0.05)，NC組BAP31表達(0.669±0.055)與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 si-BAP31轉染的HCT116細胞BAP31的蛋白表達

2.3si-BAP31轉染抑制HCT116細胞活力 與NC組比較，si-BAP31組在24、48和72 h的細胞活力均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 si-BAP31對HCT116細胞活力的影響

與NC組比較：1)P<0.05，下表同

2.4si-BAP31轉染抑制HCT116細胞侵襲能力 空白對照組穿膜細胞數(shù)(202.4±7.1)個、NC組(198.9±6.7)個、si-BAP31組(116.5±3.2)個。與NC組比較，si-BAP31組細胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

2.5si-BAP31轉染抑制HCT116細胞Wnt/β-catenin信號通路 與NC組比較，si-BAP31組β-catenin、PCNA和MMP-2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖3，表2。

圖3 si-BAP31轉染對HCT116細胞β-catenin、PCNA和MMP-2蛋白表達的影響

組別β-cateninPCNAMMP-2空白對照組0.572±0.0460.188±0.0200.162±0.017NC組0.591±0.0500.196±0.0230.157±0.015si-BAP31組0.142±0.0161)0.102±0.0101)0.082±0.0901)

3 討 論

BAP31在進化上高度保守，在哺乳動物的細胞中廣泛存在，參與新生蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生產(chǎn)和分泌過程〔7〕。有研究表明，結直腸癌DLD-1，HT29，SW620和 HCT116細胞中BAP31表達明顯高于結腸上皮細胞，且在HCT116細胞表達最高〔6〕，本研究結果與前人〔6〕一致。因此，選擇HCT116細胞為研究對象。RNA干擾(RNAi)是近些年發(fā)展起來的一種在轉錄后阻斷基因表達的新技術，能特異性、高效性的抑制基因表達，與其他基因阻斷技術比較有更多的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于腫瘤治療、基因功能研究等方面〔8,9〕。有研究表明，抑制宮頸癌中BAP31表達能降低細胞增殖、侵襲和遷移能力，并阻滯細胞于G0/G1期〔10〕。BAP31對結直腸癌細胞增殖侵襲的影響尚未明確。本研究表明BAP31表達參與結直腸癌的侵襲過程。腫瘤的侵襲轉移對患者的預后造成嚴重的影響，明確腫瘤侵襲轉移機制，并探究抑制機制將為腫瘤患者帶來福音。Wnt/β-catenin是Wnt信號通路中的經(jīng)典信號途徑，參與細胞的增殖、凋亡等過程，多種腫瘤中處于激活狀態(tài)，其激活可導致腫瘤發(fā)生〔11～13〕。β-catenin為Wnt/β-catenin信號的關鍵分子，可通過與細胞膜上的鈣黏蛋白和細胞骨架結合發(fā)揮細胞結構維持及黏附作用。結直腸癌組織中β-catenin異常堆積，而β-catenin的過表達與腫瘤浸潤深度及局部去分化有關〔14〕。也有研究表明，抑制β-catenin表達可降低結直腸癌發(fā)生發(fā)展〔15〕。腫瘤細胞侵襲轉移能力與蛋白酶降解ECM、基底膜能力密切相關。MMPs是一組重要的蛋白酶，在腫瘤侵襲及轉移過程中發(fā)揮重要作用，MMP-2為MMPs家族成員之一，在包括結直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達升高，而抑制其表達可降低癌細胞的侵襲及遷移能力〔16,17〕。PCNA是合成DNA不可缺少的因子，其表達水平可反應出細胞的增殖狀態(tài)，目前已作為細胞增殖活性檢測的指標〔18〕。本研究結果提示BAP31抑制結直腸癌增殖侵襲的機制可能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號途徑。