趙俊峰 李豪 肖耀軍 雷震 張林超 孫繼建 潘世杰 崔洪泉 陳瑞廷

(1河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002；2武警廣東總隊(duì)醫(yī)院泌尿外科，3河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

腎細(xì)胞癌(RCC)為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤3%～5%，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)〔1〕。即使通過外科手術(shù)治療，仍有20%～40%的患者在術(shù)后發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔2,3〕。因此尋找中藥治療腎癌成為熱點(diǎn),其中千金子為大戟科類干燥以后成熟的種子，現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)表明其對(duì)腎癌〔4〕、肝細(xì)胞癌〔5〕、前列腺癌〔6〕及血液系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞〔7〕均具有不同程度的抗腫瘤效果。本研究以小鼠腎癌Renca細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)千金子對(duì)腎癌細(xì)胞周期的影響及其侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 千金子二萜醇實(shí)驗(yàn)用藥品購(gòu)買自四川維克奇生物科技有限公司，純度為99%(批號(hào)：20190023)；胎牛血清、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)購(gòu)買自武漢漢恒生物科技有限公司；細(xì)胞6孔板和Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞周期的試劑盒購(gòu)買自上海碧云天生物科技有限公司。小鼠腎癌Renca細(xì)胞購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司，由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腎癌Renca細(xì)胞放置在含5%CO2、37℃的細(xì)胞恒溫箱中，含有雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞飽和度達(dá)到80%～85%后，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞后并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2千金子作用前后對(duì)腎癌Renca細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 取預(yù)先復(fù)蘇的細(xì)胞，使用含有0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞的濃度為3×105/ml，并接種到6孔板中。常規(guī)的條件下培養(yǎng)24 h后，等細(xì)胞完全貼壁，換液1次，實(shí)驗(yàn)孔滴加預(yù)先稀釋的千金子二萜醇，對(duì)照孔滴加等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24～48 h后，于倒置顯微鏡下隨機(jī)拍照，記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含有0.25%的胰蛋白酶消化后收集腎癌Renca細(xì)胞，隨即接種到6孔板中密度為1×105/孔，待細(xì)胞貼壁后，使用無血清培養(yǎng)基饑餓6 h，用200 μl的槍頭垂直于6孔板劃“1”字形的劃痕，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次。加入濃度為(9 000 μg/ml)的千金子二萜醇，以加入培養(yǎng)基組作為對(duì)照組。在劃痕時(shí)開始和千金子處理24 h后，在倒置顯微鏡下觀測(cè)劃痕的寬度并拍照。

1.2.4Transwell小室檢測(cè)千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 采用Transwell小室法體外遷移實(shí)驗(yàn)觀察和處理48 h后腎癌Renca細(xì)胞遷移能力的變化，同樣取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腎癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，PBS水化小室的基底膜，同時(shí)向小室下層內(nèi)添加500 μl不含胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，小室膜上均加入100 μl細(xì)胞懸浮液。實(shí)驗(yàn)組滴加9 000 μg/ml的千金子二萜醇溶液，對(duì)照組滴加培養(yǎng)基。放置于37℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，用含4%的多聚甲醛固定30 min、0.1%的結(jié)晶紫染色20 min以后，并取出里邊的小室，擦去沒有穿過小室膜的細(xì)胞，在顯微鏡下，隨機(jī)取5個(gè)視野(上、下、左、右、中間)觀察Transwell小室并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果取均值，并獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞增殖周期的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌Renca細(xì)胞，用單純RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，均勻加樣于6孔板中置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h貼壁后備用。實(shí)驗(yàn)組加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，對(duì)照組加入體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，預(yù)處理細(xì)胞；常規(guī)培養(yǎng)24 h后，收集各孔細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次后，將細(xì)胞重懸于0.5 ml PBS液中，迅速注入75%的預(yù)冷乙醇(4℃)冰箱固定過夜。測(cè)定時(shí)離心棄上清液2次，將細(xì)胞重懸于0.5 ml的PBS液中，加入0.5 ml的碘化丙啶(PI)溶液(含10 mg/L的RNase、0.1%Triton-100、50 mg/L PI)4℃避光染色30 min,經(jīng)過尼龍網(wǎng)過濾以后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Modfit軟件分析。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 9 000 μg/ml的千金子二萜醇作用于腎癌Renca細(xì)胞24 h后，大部分細(xì)胞體積變小、變細(xì)短圓鈍；部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，有細(xì)胞碎片漂浮。見圖1。

圖1 千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×100)

2.2千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響 千金子二萜醇處理腎癌Renca細(xì)胞48 h后，穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量〔(116.51±15.26)%〕與對(duì)照組〔(563.23±39.61)%〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞遷徙能力的影響 與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組腎癌細(xì)胞的遷移距離明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2及表1。

圖2 千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞遷徙能力的影響(×100)

表1 千金子對(duì)Renca細(xì)胞遷移距離的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，下表同

2.4千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少(P<0.05),G2/M期的細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 千金子對(duì)腎癌Renca細(xì)胞周期的影響

3 討 論

本研究基于前期發(fā)現(xiàn)中藥千金子二萜醇濃度為9 000 μg/ml時(shí)對(duì)小鼠腎癌Renca細(xì)胞存在明顯的抑制作用〔8〕，更進(jìn)一步探討其對(duì)腎癌細(xì)胞周期和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。腫瘤是細(xì)胞增殖周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞無限制地進(jìn)行分裂增殖。在臨床上抗腫瘤藥物的機(jī)理有許多是通過阻斷腫瘤細(xì)胞的分裂周期從而抑制癌細(xì)胞的增殖。Choene等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)千金子乙醇提取物作用于人腎癌細(xì)胞后，G2/M期的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，隨著藥物濃度提高處于G0期細(xì)胞數(shù)量隨之增多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，千金子可以使小鼠腎癌Renca細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞數(shù)量減少，G2/M期細(xì)胞無明顯變化。Cheng等〔4〕研究中藥千金子作用于乳腺癌(mda-mb 231)等細(xì)胞株后，處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增多，與本研究的結(jié)果一致，表明中藥千金子在不同的細(xì)胞引起細(xì)胞周期的阻滯可能并不完全一致。此外，癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的另一重要的因素，也是腫瘤治療失敗的主要原因。本研究通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比較，發(fā)現(xiàn)千金子可以有效降低腎癌Renca細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和遷徙的能力。另外，Yang等〔10〕的研究結(jié)果也表明千金子通過抑制人肺癌A549細(xì)胞腫瘤血管的生成來阻斷其侵襲和轉(zhuǎn)移，與本研究的結(jié)果基本相符。近年來研究表明PI3K-AKT-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路廣泛存在于多種細(xì)胞中，完成并參與細(xì)胞包括增殖、分裂、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等生物學(xué)行為〔11,12〕；該信號(hào)通路的表達(dá)失控與多種癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，針對(duì)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路分子靶向治療成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)〔13〕。千金子與通過該信號(hào)通路調(diào)控腎癌Renca細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制之間的關(guān)系，有待后續(xù)的研究。