紅宇 王儒帥 趙盛 王睿君

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像診斷科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院)

惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病快，70%～80%的患者多在發(fā)病半年之內(nèi)確診〔1,2〕。隨著醫(yī)療技術(shù)及新藥研發(fā)加快，針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療手段取得較大進(jìn)步，療效亦有明顯提升，但現(xiàn)實(shí)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后和存活依然沒有得到顯著改善〔3〕，加強(qiáng)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制研究和治療方法探索顯得極為緊要，開發(fā)新的藥物用于治療膠質(zhì)瘤對(duì)于提高患者療效和預(yù)后具有重要意義，蒙藥巴特日七又名為巴布敦朱日，是蒙醫(yī)臨床上治療黏熱癥及腸刺痛的最常用方劑。臨床研究表明巴特日七治療治療細(xì)菌性痢疾、扁桃體炎和銀屑病等疾病均有顯著的療效〔4,5〕，蒙藥巴特日七可明顯抑制胃癌MGC8023和結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞作用〔6〕，本研究通過建立人膠質(zhì)瘤移植瘤模型，探討蒙藥巴特日七對(duì)膠質(zhì)瘤治療作用，并就其機(jī)制作初步探討。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 U251 膠質(zhì)瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物學(xué)研究所。SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，來源北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2試劑 巴特日七味丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司)。胎牛血清購自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司，PAMAM和FA購自美國Sigma公司。兔抗小鼠的高遷移率族蛋白(HMG)B1、Toll樣受體(TLR)4、核因子(NF)-κB和β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶耦聯(lián)山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒、電光學(xué)發(fā)光(ECL)顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。RIPA裂解液、Trizol 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技北京有限公司)，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自寶日生物技術(shù)北京有限公司，引物由上海生工生物合成，Applied Biosystem 7500快速熒光定量PCR儀。垂直電泳槽和電轉(zhuǎn)儀購自北京六一儀器廠，水平搖床購自江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心去上清，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，置于37℃水浴備用。麻醉小鼠，將小鼠固定于立體定向儀上，剪去頭頂部眼裂至外耳道之間的毛發(fā)，常規(guī)消毒鋪單，于中線處眼裂后作一長(zhǎng)約1.0 cm垂直切口，暴露前囟，取其前方1.0 mm，右側(cè)距中線1.0 mm處鉆孔，其直徑約為1.0 mm，用微量注射器吸取4 μl細(xì)胞懸液，調(diào)整移動(dòng)架位置，使針尖位于骨孔處，緩慢垂直進(jìn)針，持續(xù)注射10 min，緩慢拔針，以骨蠟封閉骨窗，逐層縫合關(guān)顱，固定于電極移動(dòng)架上。正常飼養(yǎng)(57BL/6小鼠作為對(duì)照組)。

1.3.2治療方法 將模型分為四組：對(duì)照組注射無菌生理鹽水；低劑量治療組注射巴特日七味丸20 mg/kg；中劑量治療組注射巴特日七味丸40 mg/kg；高劑量治療組注射巴特日七味丸80 mg/kg，每組20只。每天灌胃給藥1次，每隔1 d測(cè)量腫瘤變化，治療12 d，脫臼處死，取腫瘤組織，并取出腫瘤稱重記錄，計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率，體積抑瘤率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均瘤體積/模型組平均瘤體積)×100%。腫瘤組織一部分用甲醛溶液保存，一部分放入液氮保存。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.3腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，將制備好石蠟切片按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于光鏡下觀察，若細(xì)胞核內(nèi)為棕黃色即為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選擇并計(jì)算5個(gè)高倍視野中凋亡指數(shù)(AI)。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.4Western印跡檢測(cè)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平 解凍組織，加RIPA裂解液裂解，12 000 r/min，4℃，離心30 min，取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，上樣50 g，根據(jù)濃度計(jì)算各個(gè)樣品所需體積，按1∶5加上樣緩沖液，隨后進(jìn)行電泳，電泳完成后，切膠。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，200 mA，120 min。5%的脫脂牛奶封閉，室溫水平搖床2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的HMGB1、TLR4和NF-κB一抗，使PVDF膜浸泡于TBST中，4℃孵育過夜。PBST洗3次，每次5 min，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗按1∶50 000稀釋，孵育HRP標(biāo)記的二抗，PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。加入ECL底物液，孵育3 min。放入顯影液顯影、定影液定影。采用IMAJ軟件對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行灰度值分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5RT-qPCR檢測(cè)HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平 解凍組織，用Trizol 試劑盒提取總RNA，均在冰上進(jìn)行操作，檢測(cè)總RNA總RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 定量檢測(cè)。GAPDH 作為內(nèi)參,引物序列：HMGB1正義鏈5'-GCGAGCATCCTGGCTTATC-3',HMGB1反義鏈5'-TTCAGCTTGGCAGCTTTCT-3';TLR4正義鏈5'-AGCAGGTGGAATTGTATCGC-3',TLR4反義鏈5'-TCAGGTCCAAGTTGCCGTTT-3';NF-κB正義鏈5'-GCATTCTGACCTTGCCTATCT-3',NF-κB反義鏈5'-CTCCAGTCTCCGAGTGAAGC-3';GAPDH正義鏈5'-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3',GAPDH反義鏈5'-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3'。反應(yīng)體系為：主要混合物12.5 μl，正義鏈0.25 μl，反應(yīng)鏈0.25 μl，模數(shù)2.5 μl，ddH2O加至20 μl，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性98℃,2 min;98℃變性30 s;60℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，72℃，5 min。監(jiān)測(cè)熒光信號(hào),獲得相應(yīng)Ct 值。每樣本設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算平均Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法表示獲取mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1蒙藥巴特日七抑制腫瘤生長(zhǎng) 治療12 d后，分析各劑量組的腫瘤抑制情況。與模型組比較，蒙藥巴特日七的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系(P<0.05)，見表1。

表1 腫瘤體積和抑制率

與模型組比較：1)P<0.05；與低劑量組比較：2)P<0.05；與中劑量組比較：3)P<0.05，下表同

2.2膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡指數(shù) TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組AI為〔(10.64±1.36)%〕，與對(duì)照組〔(41.25±5.16)%〕相比，明顯降低(P<0.05)，蒙藥巴特日七治療后，AI明顯增加，且隨著劑量的增加，AI增加越明顯〔低劑量組(18.13±2.29)%，中劑量組(25.36±3.15)%，高劑量組(33.52±4.28)%,P<0.05〕。

2.3HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，與模型組相比，蒙藥巴特日七治療后HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白明顯降低，且隨著劑量增加，蛋白減弱越明顯，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，見圖1，表2。

圖1 HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

組別HMGB1TLR4NF-κB模型組0.98±0.050.89±0.051.47±0.11低劑量組0.76±0.031)0.67±0.041)1.19±0.091)中劑量組0.51±0.021)2)0.43±0.061)2)1.02±0.061)2)高劑量組0.22±0.031)2)3)0.19±0.021)2)3)0.45±0.031)2)3)

2.4HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá) RT-qPCR結(jié)果結(jié)果顯示，與模型組相比，HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，蒙藥巴特日七治療后三種 mRNA明顯減弱，且隨著劑量增加， mRNA減弱越明顯，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，見表3。

表3 各組HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)

3 討 論

膠質(zhì)細(xì)胞瘤在手術(shù)中徹底切除腫瘤存在較大困難。故膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高和預(yù)后較差。放化療法能夠殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞，但其不具特異性，故會(huì)造成嚴(yán)重副反應(yīng)，目前尚不明確發(fā)病機(jī)制，臨床上尚未具備根本治療的方法。因此，尋找新的有效的治療藥物仍然至關(guān)重要〔7,8〕。蒙藥治療腫瘤具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，用藥少，其療效好且安全性較高，且毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤作用機(jī)制的研究逐漸成為醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)。蒙藥巴特日七味丸具有清熱解毒、消黏的功效，為腸道及黏熱癥的常用主方，鄧秀玲〔9〕研究顯示蒙藥巴特日七能抑制MGC-803細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥巴特日七味丸呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系地抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)〔10,11〕。腫瘤細(xì)胞之所以可無限增殖和生長(zhǎng)，最重要的是細(xì)胞凋亡機(jī)制明顯異常。HMGB1 屬于一種染色質(zhì)非組蛋白核蛋白〔12〕，細(xì)胞外的HMGB1可結(jié)合其受體TLR4激活細(xì)胞NF-κB通路，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究報(bào)道膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中HMGB1、TLR4均與病理特征密切相關(guān)，HMGB1/TLR4/NF-κB可能直接參與膠質(zhì)瘤的發(fā)病〔13,14〕。本研究提示蒙藥巴特日七味丸可能通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤。