顧建忠 李海 黃凌凌 陳建海 黎飚 楊潔 方曉燕

(右江民族醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，廣西 百色 533000)

Ⅰ型骨質疏松臨床上也叫絕經(jīng)后骨質疏松(PMOP)，絕經(jīng)后卵巢萎縮退化，女性激素分泌銳減，護骨素血液隨之下降，成骨細胞成骨功能得不到保護，反而破骨細胞功能亢進，引起溶骨大于成骨，導致總骨質量較少，骨質松散變脆，輕則腰酸背痛腿抽筋，重者骨折。臨床雌激素(E2)對PMOP防治效果較好，但令人擔憂是日益顯現(xiàn)的毒副作用〔1，2〕。本研究主要探討山茶籽對去卵巢大鼠血清護骨素和股骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1材料 96只5月齡雌性SD大白鼠(300～350 g；SPF級)，榨油后的廣西百色市凌云山區(qū)的山茶籽剩余物：茶麩，茶麩經(jīng)過石油醚進行3次重復脫脂，用濃度為95%的乙醇3次回流得到提取沉積物，并將提取物合并，并進行低溫濃縮至8.6 g/g生藥的濃度，濃縮乙醇提取物經(jīng)過無菌處理后置于冰箱2～5℃密封狀態(tài)下保存?zhèn)溆?。給實驗大鼠用藥再臨時加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液。苯甲酸注射E2針劑 (每支100 μg，浙江省仙居制藥有限公司，批號：20162086)。

1.2實驗動物大鼠分組 在去卵巢和假手術之前把96只實驗大鼠進行隨機分成4組，假去卵巢(Sham)組、去卵巢動物模型(OVX)組、去卵巢+苯甲酸注射E2(E2)組、去卵巢+山茶籽醇提物稀釋液(Ts)組，每組24只，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，用標準規(guī)格飼料，飲水機自由給水。用藥后各組大鼠通風、照明、濕度、溫度和飼料各個飼養(yǎng)條件均相同。

1.3去卵巢動物模型建立 取OVX組、E2組、Ts組大鼠，配濃度為10 g/L戊巴比妥鈉麻醉液，按3.0 mg/kg劑量，局部消毒后腹腔注射，待大鼠進入麻醉狀態(tài)消毒條件下在背部雙切開進入腹腔，切去兩側卵巢，切口由內向外依次分層縫合。切除所得卵巢的組織學塊，經(jīng)固定切片染色進行組織學鑒定確認。術后用注射卡那霉素液涂擦手術切口，連續(xù)3 d，避免手術切口化膿感染。術后1 w開始實驗用藥。Sham組操作方法和步驟同上，但不切去卵巢，只摘除貼附在卵巢的一近似卵巢大小塊的脂肪塊。術后用注射卡那霉素液涂擦手術切口，連續(xù)3 d，避免手術切口化膿感染。

1.4給藥方法 (1)Ts組：將8.6 g/g的山茶籽醇提物加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液，按10 ml/(kg·d)劑量進行灌胃。(2)E2組，E2 200 μg/kg，左右兩側大腿交替皮下注射，注射口按壓2 min，2次/w。(3)Sham組及OVX組，無菌生理鹽水灌胃，按10 ml/(kg·d)劑量進行灌胃。

1.5檢測指標及方法 各實驗動物組從第4周起，每隔4 w處死一批大鼠。即第4、8、12和16周每組取6只實驗大鼠，經(jīng)腹腔注射濃度為10 g/L戊巴比妥鈉溶液，按3.0 mg/kg劑量，進行腹腔適度麻醉，經(jīng)左心室取血完畢后再，常規(guī)處死。(1)各組大鼠右側股骨骨組織結構：分離右側股骨，取股骨頭1 cm，按常規(guī)骨組織制片過程：10%甲醛固定24 h、經(jīng)酸溶液快速脫鈣、梯度酒精脫水、熱熔石蠟進行包埋，石蠟組織塊冷卻后進行切片，最后進行蘇木素-伊紅(HE)染色。放大200倍觀察各組光鏡骨組織結構；(2)各組大鼠左側股骨骨鈣：左側股骨頭剝離干凈周圍軟組織，并取近端1 cm。取左側的股骨頭集中放置瓷性烤盤，并置恒溫烤箱內，經(jīng)105℃恒溫烤48 h直到恒重。北京愛尚陽光科技有限公司的十萬分之一實驗室分析天平稱其質量，將干骨置于坩堝進行炭化到無煙為止，把溫度降到600℃，保持恒溫1 h，加入20%的鹽酸(HCl)輕輕攪拌至完成溶解，再加入去離子水到需要容量刻度，用上海美譜達儀器有限公司的WFX-IE2型原子吸收分光光度計進行股骨頭骨鈣測定。(3)用骨鈣相同方法使股骨頭烘干脫水至恒重，稱其烘干股骨質量后，放入容量為10 ml的容器瓶中，注入20%的HCl于容器瓶中并封其口，把容器瓶放在恒溫烤箱中，110℃恒溫24 h，使股骨全部溶解。最后取出股骨容器瓶注入去離子水至相應容量刻度，用上海晶抗生物工程有限公司生產的磷試劑盒，上海光學儀器廠726型可見分光光度計測定股骨頭骨磷的含量。(4)各組大鼠血清護骨素：大鼠麻醉后切開胸腔用采血器穿刺左心室吸取心血5 ml，經(jīng)過離心器以4 000 r/min進行10 min離心分離，沉淀獲取血清，置于低溫(-20℃)冰箱保存。用酶聯(lián)免疫吸附試驗按試劑盒操作說明測定血清護骨素。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SSPS18.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1各組骨組織形態(tài)結構 Sham組骨組織骨質致密，骨皮質較厚，骨細胞規(guī)則密集，小梁粗且均勻，骨小梁排列有序，有明顯橫向連接。OVX組骨質薄，骨細胞稀少，骨小梁疏而細小、骨小梁斷裂、紊亂，骨小梁之間腔隙較大，骨質明顯疏松；E2組和Ts組與OVX組比較，骨皮質厚度和骨質密度明顯增加，疏松骨質病理改善顯著，骨質內部小梁較OVX組明顯增密、增粗，骨質之間腔隙變小而少。E2組和Ts組骨組織切片放大200倍光鏡下的結構形態(tài)相似。見圖1。

2.2各組骨鈣測量結果 OVX組在第4、8、12、16周采樣骨鈣顯著低于同時期其他3組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周骨鈣與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組骨磷測量結果 OVX動物組在第4、8、12、16周骨磷明顯低于同時期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周的骨磷與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.4各組血清護骨素檢測結果 OVX組在第4、8、12、16周血清護骨素顯著低于同時期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周血清護骨素與同時期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

組別骨鈣第4周第8周第12周第16周Sham組170.35±10.471)168.69±16.231)170.12±12.201)171.60±11.301)OVX組148.26±12.22147.53±8.60146.59±10.16147.68±11.51E2組166.50±12.091)169.16±16.201)169.28±12.231)172.18±13.121)Ts組 162.40±13.431)164.59±15.361)166.26±13.651)168.29±13.281)組別骨磷第4周第8周第12周第16周Sham組101.20±10.31)99.89±12.181)97.58±10.141)98.98±13.101)OVX組80.33±10.3279.89±10.1580.40±9.7278.12±10.12E2組102.33±12.301)99.32±13.081)98.38±11.281)98.10±10.121)Ts組 97.20±10.061)96.22±11.211)95.12±13.051)96.82±12.321)

與OVX組比較：1)P<0.05；表2同

表2 各組血清護骨素檢測結果

3 討 論

骨質內鈣化骨小梁多少用骨量表示，鈣化的骨基質把骨細胞之間各種纖維包含在其中，形成堅硬骨基質，當成骨細胞功能優(yōu)于破骨細胞功能時，骨小梁粗而密，骨質結實而堅硬；當成骨細胞功能劣于破骨細胞功能時，骨小梁小而疏，骨質變脆易斷，也稱為骨質流失，導致骨質疏松。當卵巢功能正常時，足量女性雌激素水平維持成骨細胞正常功能〔3〕，而拮抗破骨細胞，成骨細胞功能大于破骨細胞功能，骨質生成與流失平衡，骨質保持正?！?～7〕。絕經(jīng)期女性，卵巢退化，卵巢功能下降，低量女性雌激素水平不維持成骨細胞功能，而拮抗不了破骨細胞，成骨細胞功能劣于破骨細胞功能，骨質生成量小于流失量，骨量自然減少，骨質出現(xiàn)疏松〔8，9〕。雌性SD大鼠去卵巢很好模擬絕經(jīng)女性卵巢功能退化導致雌激素水平下降所致骨質疏松，所以出現(xiàn)OVX組的骨鈣、磷和血清護骨素明顯低于其他3組。股骨頭部骨質切片有顯著骨小梁變小，變疏松的病理改變〔10，11〕。本研究結果表明雌激素可以提高成骨細胞功能的成骨功能，拮抗雌激素減少引起骨質疏松，提高血鈣、磷和護骨素。也可能是雌激素通過增加護骨素，再通過護骨素提高成骨細胞的成骨功能，增加骨質生成，最終提高骨密度〔12，13〕。

本研究結果說明山茶籽醇提物有雌激素樣作用，屬于植物性雌激素。山茶籽醇提物可以提高護骨素，增加骨量，拮抗雌激素減少導致的骨質疏松〔14，15〕。如果進一步實驗證明山茶籽醇提物能防治PMOP，將為臨床防治PMOP提供實驗依據(jù)。如果臨床推廣山茶籽醇提物防治PMOP，可以大大減輕雌激素防治PMOP毒副作用，不僅提高患者生活質量，減輕社會和家庭負擔，也可以使廣大山區(qū)的山茶籽榨油后的茶麩充分利用，大大提高其經(jīng)濟效益。