屠葉平 侯月梅 金曉媛 張曉雅

(1上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院老年科，上海 201499；2南方醫(yī)科大學)

心房顫動(房顫)是臨床上最常見的心律失常之一，目前仍主要依靠藥物轉復，開發(fā)安全有效的抗房顫藥物是研究的熱點〔1〕。多非利特是一種新型的純Ⅲ類抗心律失常藥物，通過特異性阻斷快鉀通道使心肌細胞復極延長〔2〕。研究表明多非利特具有較好的轉復心房撲動(房撲)、房顫維持竇性心律作用，在國外已應用于臨床房撲和房顫的治療，但在應用過程中通過延長動作電位可導致尖端扭轉型室性心動過速(室速)的發(fā)生，且與濃度相關〔3,4〕。本研究應用微電極陣(MEA)技術結合心腔內電生理技術，研究不同濃度多非利特對兔右心房快速起搏(RAP)模型電生理特性的影響，以探索出更嚴格的藥物使用安全范圍。

1 材料和方法

1.1實驗動物和分組 純種新西蘭大白兔40只，不限雌雄，體重2.0～3.0 kg,均購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SYXK(粵)2011-0074。隨機分成5組各8只，對照組、起搏組、多非利特A組(10-5μmol/L)、多非利特B組(10-4μmol/L)、多非利特C組(10-3μmol/L)。

1.2實驗試劑、溶液成分和儀器 改良臺氏液成分(mmol/L):NaCl 144；KCl 5.0；CaCl21.8；MgCl21；NaH2PO4；HEPES 5.0；葡萄糖10〔5〕(NaOH 滴定至pH 值為7.4)。多非利特(批號：F6331，美國Sigma公司)，以上均為國產分析純。MEA系統(tǒng)(Microeletrode arrays MEA64 System,MCS Gmbh,德國)，主要配置為柔性電極(64位點)，余包括MC-Rack軟件包、USB-ME64轉換卡、Stimulus Generator刺激儀、PGA64 放大器等。

1.3建立兔快速心房起搏模型 將戊巴比妥鈉(3%)按照劑量30 mg/kg，通過兔耳緣靜脈注射麻醉，再靜推800 U肝素抗凝。將兔固定在兔臺上，沿頸部正中做切口，分離右側頸內靜脈后切開，結扎近頭端〔6〕。使用電生理儀LEAD-7000(四川錦江電子科技)同時記錄兔體表心電圖(Ⅱ導聯(lián))和高右房心腔內電圖，插入一根6F的兩極電極導線至右心房做起搏和記錄。當心腔內電生理圖出現(xiàn)高大A波、小V波時，記錄圖形較理想，此時固定電極導線〔7〕。以600次/min的固定頻率進行RAP 24 h。正常對照組僅植入起搏電極導線，不做高位右心房快速起搏〔8〕。

1.4標本制備 RAP 24 h后，開胸取出心臟，迅速放置于充氧的4℃改良臺氏液中，擠壓心臟排出心腔內多余積血，對心臟進行簡單修剪〔6〕。啟動離體心臟灌流系統(tǒng)，改良臺氏液流速設為12 ml/min,使用數(shù)控恒溫循環(huán)水槽ALC-CWB將溫度控制在37℃，臺氏液中通以95%O2+5%CO2的混合氣體(pH<7.5)〔9〕。分離后提住主動脈，將灌注管道插至冠狀動脈開口上方處，用絲線打結固定后開始灌注。使用Stimulus Generator刺激儀做驅動刺激，刺激強度大于2倍閾值，波寬2 ms,頻率1 Hz，選擇25號為刺激電極導線正極34號為負極。心臟穩(wěn)定30 min后開始記錄心房肌場電位和興奮傳導的變化。

1.5給藥方法 多非利特經雙蒸水溶解后按照設定的最終藥物濃度(10-5μmol/L、10-4μmol/L和10-3μmol/L)混入改良臺氏液中。改良臺氏液中加入多非利特后pH會發(fā)生改變，借助臺氏pH劑，使用NaOH/HCl 重新將pH 滴定至7.4。

1.6MEA系統(tǒng) MEA系統(tǒng)柔性電極由MEA1、MEA2組成，是在柔性塑料片基質頭部1.8 mm×1.8 mm的區(qū)域，以6×6分布形式植入32個金電極。記錄電極直徑50 μm，相鄰間隔300 μm。原理：柔性電極記錄的原始電信號，通過放大器PGA64增益100倍后，由模數(shù)轉換卡USB-ME64數(shù)字化，最后使用軟件MC-Rack處理〔9〕。場電位參數(shù)(FPmin)第一個負向波峰值(FPmin)、最后一個正向波峰值(FPmin)，fAPD:從FPmin到FPmax 的時間〔10〕。興奮傳導速度=距離÷時間，32電極之間距離固定，興奮的時間差即為興奮傳播所需時間。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t，方差不齊時采用Dunnettt檢驗。

2 結 果

2.1兔RAP模型 RAP時，當體表心電圖變得紊亂，P波消失，R-R間期不等，f波出現(xiàn)，頻率達450～600次/min(圖1)，且持續(xù)時間超過10 s，表明AF模型制作成功，本實驗成功率達95%。

Ⅱ：體表Ⅱ導聯(lián)心電圖； HRA:高右房心腔內電圖圖1 RAP兔房顫

2.2起搏組兔心房肌fAPD、CV與HR的變化 兔離體心臟成功行Langendroff灌流后,對25號(+)和34號(-)電極施加2 V電壓，2 ms脈寬,延時100 ms連續(xù)刺激右房30 min。實驗過程中25號和34號均顯示為一條直線，無生物電信號產生。因兔心肌大小和柔性電極放置位置存在差異，會對數(shù)據(jù)造成一定影響，故各組所有數(shù)據(jù)采用場電位信號穩(wěn)定、清晰的35號為原始研究數(shù)據(jù)。相較于對照組，起搏組fAPD明顯縮短，CV明顯減慢，HR明顯加快，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，見表1。

表1 各組fAPD、CV和HR的比較

與對照組比較:1)P<0.05;與起搏組比較:2)P<0.05

2.3多非利特組兔心房肌fAPD、CV與HR的變化 相較于起搏組，多非利特組fAPD與HR分別呈濃度依賴性延長與減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CV則無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，圖2。

1～5：對照組、起搏組、多非利特A組、非利特B組、多非利特C組圖2 各組場電位時限變化

3 討 論

MEA技術在抗心律失常藥物研發(fā)和藥物梯度濃度研究中都可取得理想效果，其通過多位點實時、同步記錄多細胞群的電活動，利用用藥后組織細胞fAPD、CV、自主節(jié)律等參數(shù)的變化來評價其藥物效應及藥物不同濃度的作用效果〔11,12〕。柔性電極問世后，能夠應用MEA技術進行離體小動物整體心臟電生理方向的研究。在藥物研發(fā)過程中，離體心臟實驗相較于在體心臟實驗具有明顯優(yōu)勢，能夠消除神經、體液等內環(huán)境調節(jié)作用對藥物效果的干擾。本實驗應用MEA結合心內電生理技術，在Langendorff改良臺氏液灌流條件下，可清楚、穩(wěn)定地在較長時間內觀察到兔離體心臟在基礎狀態(tài)、RAP后和多非利特干預下 fAPD、CV和自主節(jié)律的變化，并且能夠快速、敏感地顯示出不同濃度多非利特(10-5、10-4、10-3μmol/L)的作用差異。

迄今為止，國內外關于房顫模型的研究較多，已建立了較多的房顫模型，包括以犬等大型動物為代表的房顫模型和以兔等中型動物為代表的房顫模型〔13〕。使用RAP方法制作的兔房顫模型與臨床觀測的房顫在結構和功能上均具有一定共性，房顫誘導后能夠維持，不會自行終止，進行干預后能有效被終止〔14,15〕。因而RAP在房顫的電生理研究領域得到了廣泛應用。本實驗應用MEA結合心內電生理技術進行多非利特對RAP模型干預的研究是一次創(chuàng)造性地嘗試，不僅房顫模型穩(wěn)定性、重復性好且貼近臨床，在盡可能消除外界其他干擾條件下，直觀抗房顫藥物對房顫模型的影響，為今后抗心律失常尤其是抗房顫藥物的研發(fā)構建了典范平臺。

抗心律失常藥物在對抗心律失常的同時往往能誘發(fā)心律失常的發(fā)生，藥物引起QT間期延長是目前安全藥理學中關注的主要問題。盡管多非利特已在國外上市用于房撲、房顫的治療，但因其具有延長QT間期而導致尖端扭轉型室速的副作用，且呈濃度相關性〔16〕，因此多非利特的藥物安全劑量范圍仍需進一步研究。本研究顯示，10-5、10-4、10-3μmol/L 多非利特在短時間內均可延長fAPD、減慢HR，對CV則無明顯影響。濃度在10-5～10-4μmol/L時，對fAPD、HR影響相對較小，濃度達10-3μmol/L時，可使fAPD明顯延長、HR明顯減慢，故濃度低于10-3μmol/L是相對安全的藥物劑量范圍。由于多非利特不影響CV，所以其減慢HR主要與抑制自主節(jié)律有關，且與fAPD呈負相關。因此，在臨床上應用多非利特時，要嚴格把握藥物安全劑量范圍，注意觀察HR與QT間期的變化，防止因QT間期延長引發(fā)尖端扭轉型室速等心律失常發(fā)生。

應用MEA結合心內電生理技術在RAP模型中進行抗心律失常藥物的研究是一種行之有效且理想的技術手段，將為推進該研究領域的進一步發(fā)展起到重要作用。在兔RAP模型中，多非利特可濃度依賴性地延長fAPD與減慢HR，對CV則無影響，顯示出較好的抗房顫作用，濃度低于10-3μmol/L是相對安全的藥物劑量范圍。本研究對該藥今后在國內的上市具有重要參考意義。