樊成紅 張曉延

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院檢驗(yàn)系，山西 汾陽 032200)

穿心蓮別名春蓮秋柳、苦膽草，主要生長在我國南方廣東、福建各省，味苦性寒，是一種生爵床科草本植物。穿心蓮根部可提取出黃酮類化合物，葉部可提取內(nèi)酯類化合物〔1〕。穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一〔2〕。研究表明，穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物穿琥寧注射液、蓮必治注射液、病毒凈滴眼液、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯等均具有消炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗心血管疾病、保肝利膽等功效，最顯著的為免疫刺激作用〔3,4〕。有研究報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯可通過刺激機(jī)體產(chǎn)生各種免疫活性物質(zhì)而發(fā)揮作用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體非特異免疫功能，其對自然殺傷(NK)細(xì)胞、細(xì)胞因子的分泌具有調(diào)節(jié)作用〔5〕。但穿心蓮內(nèi)酯的免疫調(diào)節(jié)作用未十分清楚。腸道菌群會(huì)產(chǎn)生大量的代謝酶，不同種類的細(xì)胞產(chǎn)生不同的代謝酶，不同的酶參與不同的藥物代謝。這些細(xì)菌可通過藥物活化使無活性的藥物轉(zhuǎn)化為有活性藥物，同時(shí)使有害物質(zhì)無毒化，改善腸道菌群〔6〕。中藥和腸道菌群的相互作用對研究中藥藥效具有重要作用〔7〕。但穿心蓮內(nèi)脂對腸道菌群的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全清楚。本研究將建立氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型，觀察高劑量和低劑量的穿心蓮內(nèi)酯對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬、腸道菌雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量的影響，揭示穿心蓮內(nèi)酯可提高機(jī)體非特異性免疫力及改善腸道菌群，將可為穿心蓮內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠60只(18～20 g)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2主要藥材、試劑 穿心蓮內(nèi)酯購于天津匯綠公司，純度98%，批號(hào)：170825；腸桿菌培養(yǎng)基(VRPD)、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基(BBL)、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)培養(yǎng)基均購自北納生物；氫化可的松注射液購自上海信宜藥廠，批號(hào):160316；可溶性淀粉，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170613；腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑盒、干擾素(IFN)-γ檢測試劑盒均購自碧云天。

1.3氫化可的松誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型的建立 隨機(jī)選取20只小鼠分為模型組、對照組。模型組小鼠灌胃氫化可的松，2次/d，0.2 ml/次(100 mg/kg)，連續(xù)3 d，制造小鼠免疫抑制模型；對照組灌喂等量生理鹽水。3 d后斷頸法處死小鼠，解剖摘取脾臟和胸腺，分別稱重并記錄。模型組小鼠的脾臟胸腺指數(shù)=脾臟重量(mg)/胸腺重量(g)。

1.4對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬的測定 用超純水100 ml加入可溶性淀粉1 g充分溶解，于121℃高壓滅菌20 min，自然冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆?。抽取雞血5 ml，加入抗凝劑，1 500 r/min離心3 min,棄去上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再次離心3 min。壓積細(xì)胞制備10 %紅細(xì)胞懸液。取40只小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，標(biāo)記為對照組、模型組、高劑量穿心蓮內(nèi)酯組、低劑量穿心蓮內(nèi)酯組。按1.3方法對高劑量穿心蓮內(nèi)酯組、低劑量穿心蓮內(nèi)酯組和模型組建立小鼠免疫抑制模型，第4天開始，連續(xù)3 d，固定每日上午灌胃高劑量(200 mg/kg)和低劑量(100 mg/kg)的穿心蓮內(nèi)酯，模型組腹腔注射等量的生理鹽水，對照組不做處理。第7天下午各組腹腔注射5 %無菌淀粉注射液0.5 ml，1 h后注射10 %雞紅細(xì)胞懸液1 ml，間隔1 h將小鼠處死，吸取腹腔滲出液涂片，瑞氏染色計(jì)數(shù)吞噬百分率。

1.5對免疫抑制小鼠腸道菌群的測定 采取各組小鼠腸道內(nèi)容物于1 ml無菌EP管，取1 g置于裝有9 ml無菌無氧稀釋液的稀釋管中，充分搖蕩10 min，以此為第1管(10-1)，從中取1 ml注入第2管，以此類推，直至第10 管(10-10)。 測定雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌的含量。雙歧桿菌用BBL培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)，腸桿菌用VRPD培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳酸桿菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，腸球菌用TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)，均在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。采用平板菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)菌量，最后用每克新鮮樣品中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對數(shù)表示。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量 按照TNF-α檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、IFN-γ檢測試劑盒操作要求檢測巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1氫化可的松誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型 與對照組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表1。氫化可的松成功誘導(dǎo)小鼠免疫抑制。

2.2氫化可的松對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力及血清免疫因子表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組巨噬細(xì)胞吞噬率顯著降低(P<0.05)，巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 氫化可的松對免疫小鼠免疫器官質(zhì)量的影響

表2 氫化可的松對小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力、血清免疫因子表達(dá)及腸道菌群的影響

2.3氫化可的松誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào) 與對照組比較，模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌含量顯著降低，腸桿菌、腸球菌含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4穿心蓮內(nèi)酯可逆轉(zhuǎn)氫化可的松對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力及血清免疫因子表達(dá)的作用 低劑量穿心蓮內(nèi)酯組、模型組與對照組比較，巨噬細(xì)胞吞噬率均顯著降低(P<0.05)，吞噬指數(shù)顯著降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內(nèi)酯組與對照組比較，巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)無明顯差異，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內(nèi)酯組、低劑量穿心蓮內(nèi)酯組與模型組比較，細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)顯著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著升高(P<0.05)； 高劑量穿心蓮內(nèi)酯組與低劑量穿心蓮內(nèi)酯組比較，細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)顯著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 穿心蓮內(nèi)酯對氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與低劑量穿心蓮內(nèi)酯組比較:3)P<0.05；表4同

2.5穿心蓮內(nèi)酯改善氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠腸道菌群失調(diào) 低劑量穿心蓮內(nèi)酯組、模型組與對照組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著降低，腸桿菌、腸球菌含量均顯著升高(P<0.05)；高劑量穿心蓮內(nèi)酯組與對照組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量均無顯著差異(P>0.05)，高劑量穿心蓮內(nèi)酯組、低劑量穿心蓮內(nèi)酯組與模型組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著升高，腸桿菌、腸球菌含量均顯著降低(P<0.05)；高劑量穿心蓮內(nèi)酯組與低劑量穿心蓮內(nèi)酯組比較，雙歧桿菌、乳酸桿菌含量均顯著升高，腸桿菌、腸球菌含量均顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 穿心蓮內(nèi)酯改善氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠腸道菌群失調(diào)

3 討 論

隨著我國中藥藥理研究的深入，穿心蓮已為我國中藥現(xiàn)代化的產(chǎn)業(yè)開發(fā)的重要產(chǎn)品〔8〕。早在10年前《美國草藥典》已對穿心蓮內(nèi)酯等主要穿心蓮藥用成分做出規(guī)定，標(biāo)志穿心蓮正式進(jìn)入歐美市場〔9〕。機(jī)體的免疫系統(tǒng)包括特異性免疫和非特異性免疫，其中非特異性免疫是人類在長期的進(jìn)化過程中建立起來的天然防御機(jī)制，其主要由機(jī)體屏障結(jié)構(gòu)、吞噬細(xì)胞、體液中的抗微生物物質(zhì)發(fā)揮功能〔10〕。機(jī)體內(nèi)具有吞噬功能的細(xì)胞均稱為吞噬細(xì)胞，包括小吞噬細(xì)胞，即外周血中的中性粒細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞，即血液中的單核細(xì)胞、組織中的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，其均對體內(nèi)衰老死亡細(xì)胞和異物具有吞噬功能〔11〕。吞噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通常指大吞噬細(xì)胞的檢測實(shí)驗(yàn)，判斷機(jī)體的非特異性免疫。早在2009年呂世明等〔12〕在研究呼吸道非特異性免疫中，用鼠傷寒沙門菌滴鼻建立小鼠肺損傷模型，通過對穿心蓮內(nèi)酯處理小鼠的肺指數(shù)、吞噬細(xì)胞吞噬力、溶菌酶活性、T淋巴細(xì)胞活性綜合評(píng)分，揭示穿心蓮內(nèi)酯可提高小鼠呼吸道非特異性免疫水平。由于穿心蓮的水溶性差，導(dǎo)致體外研究的結(jié)果不理想，但穿心蓮內(nèi)酯的體內(nèi)治療作用是公認(rèn)的。早在1986年黃添友等〔13〕研究報(bào)道，穿心蓮內(nèi)脂可使小鼠胸腺萎縮，外周血T淋巴細(xì)胞減少，降低腹腔滲出細(xì)胞(PFC)數(shù)和血清綿羊紅血球(SRBC)抗體效價(jià)及遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。20年后彭光勇等〔14〕發(fā)現(xiàn)，蓮必治注射液可提高豚鼠單核巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬率及人外周血中NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-α、IFN-γ、TNF-α。江冬青等〔15〕在研究穿心蓮時(shí)也發(fā)現(xiàn)，中藥穿心蓮對人類的免疫功能具積極有影響。本研究檢測了穿心蓮治療的氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的脾臟胸腺指數(shù)和吞噬細(xì)胞吞噬能力發(fā)現(xiàn)，高劑量穿心蓮內(nèi)酯可恢復(fù)小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力至對照組水平，提示高劑量穿心蓮可明顯提高機(jī)體非特異性免疫，為穿心蓮內(nèi)酯的用于臨床治療提供用藥參考。

腸道微生物是人類健康和疾病的重要決定因素，這些微生物分為兩類，即有害菌、有益菌〔16〕，其總體數(shù)量約為100萬億個(gè)細(xì)菌，包括30個(gè)屬的500多種菌。腸道菌大多為厭氧菌，其中雙歧桿菌和乳酸桿菌為腸道主要有益菌，與其他厭氧菌一起保持腸道正常微生態(tài)平衡〔17〕。當(dāng)機(jī)體在環(huán)境污染、手術(shù)外傷、精神不佳、免疫抑制劑、抗癌劑等不利因素下會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，使致病菌腸桿菌、腸球菌大量繁殖，雙歧桿菌、乳桿菌有益菌減少，造成腸道菌群紊亂，低機(jī)體天然免疫〔18〕。20世紀(jì)初，研究者發(fā)現(xiàn)，穿心蓮可改善草魚腸道菌群平衡〔19〕，可體外抑制銅綠假單胞菌系統(tǒng)使肝硬化大鼠腸道細(xì)菌感染患者受益〔20〕。Gao等〔21〕發(fā)現(xiàn)，穿心蓮模型的肺損傷脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠能夠明顯減輕。史艷平等〔22〕研究報(bào)道，炎琥寧注射液聯(lián)合思聯(lián)康應(yīng)用，具有清熱燥濕、抗病毒、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，對嬰兒病毒性腸炎具有較好的療效。本研究檢測了穿心蓮治療氫化可的松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠腸內(nèi)容物中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌含量與未處理小鼠比較發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可提高腸道菌群有益菌的含量，提示穿心蓮內(nèi)酯具有改善腸道菌群作用。這些結(jié)果為穿心蓮內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供更充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯可提高機(jī)體免疫力，改善腸道菌群，這些發(fā)現(xiàn)將為中藥穿心蓮的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。