肖聰聰 李博 鄭體花 鄭慶印

(煙臺(tái)濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000)

中耳炎的病程遷延，可引起注意力、認(rèn)知感及聽力下降，從而影響生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可以并發(fā)顱內(nèi)外并發(fā)癥而危及生命〔1～3〕。中耳炎是導(dǎo)致聽力下降的主要原因，及時(shí)對(duì)其診斷及治療有著重要意義。中耳炎小鼠模型的建立對(duì)中耳炎易感基因的識(shí)別處理及藥物開發(fā)尤為重要，但是關(guān)于中耳炎小鼠模型的聽覺特點(diǎn)尚不清楚，因此對(duì)中耳炎小鼠模型的聽力損失程度及性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估尤為重要。聽性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試是聽功能研究的重要指標(biāo)和手段，具有客觀、易操作且能夠反映病變的部位及通路，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物模型的聽力評(píng)估。本研究通過對(duì)C57小鼠，Toll樣受體(TLR)2-/-小鼠的中耳炎模型進(jìn)行ABR測(cè)試，觀察兩種小鼠在不同刺激聲下的ABR的反應(yīng)閾和潛伏期，為中耳炎小鼠模型的聽覺研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57小鼠、TLR2-/-小鼠各20只(南京大學(xué)模式動(dòng)物研所提供)(20耳，均選擇左耳測(cè)試)，均為雌性，聽力正常，7周齡，體重18～28 g。分為4組，中耳炎造模前C57小鼠一組(20只)作為對(duì)照組，中耳炎造模后C57小鼠一組(20只)作為實(shí)驗(yàn)組，中耳炎造模前TLR2-/-小鼠一組(20只)作為對(duì)照組，中耳炎造模后TLR2-/-小鼠一組(20只)作為實(shí)驗(yàn)組，即兩種品系小鼠造模前兩組對(duì)照組各20只，造模后兩組實(shí)驗(yàn)組各20只。

1.2中耳炎動(dòng)物模型的建立 兩對(duì)照組均正常飼養(yǎng)，其余兩實(shí)驗(yàn)組均在麻醉狀態(tài)下向左耳中耳腔鼓室注射鏈球菌肽聚糖多糖(PGPS)(濃度為6 μg/μl，每只注射10 μl，美國BD公司)，3 d后使用內(nèi)鏡觀察中耳鼓室情況。

1.3ABR檢測(cè) 分別對(duì)兩種品系小鼠的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腹腔注射麻醉，記電極置顱頂，參考電極插入小鼠左耳與嘴角之間，接地電極插入右耳旁與左耳對(duì)稱。電極之間阻抗小于3 kΩ。開放聲場(chǎng)中揚(yáng)聲器(TDT MFI-1250)放置于距外耳道口1 cm的地方，避免耳機(jī)接觸耳廓〔4〕。

采用美國TDT公司TDTⅢ設(shè)備和BioSigRP系統(tǒng)軟件給聲并采集信號(hào)〔5〕。刺激聲分別為校準(zhǔn)好的click聲、tone burst(TB)聲(8、16、32 kHz)，強(qiáng)度為0～90 dB SPL，衰減間隔為10 dB，接近閾值時(shí)以5 dB減低以獲得最低聽閾值，帶通濾波100～3 000 Hz，重復(fù)率11次/s，觀察窗為10 ms，疊加1 024次記錄所有波形圖及各刺激聲下的閾值，根據(jù)閾值最有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的刺激聲條件下來判斷潛伏期。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)用GraphPad Prism7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.14組小鼠內(nèi)鏡圖像 如圖1所示，麻醉狀態(tài)下，TLR2-/-小鼠實(shí)驗(yàn)組耳內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)中耳有滲出液，得到這種圖像的小鼠16只，TLR2-/-小鼠對(duì)照組使用耳內(nèi)鏡觀察無異?，F(xiàn)象。C57小鼠實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)耳內(nèi)鏡中耳有滲出液的11只，C57小鼠對(duì)照組使用耳內(nèi)鏡觀察也無異常現(xiàn)象。

圖1 4組內(nèi)鏡圖像

2.24組小鼠ABR反應(yīng)閾 由表1可見，不同刺激聲下，TLR2-/-中耳炎模型小鼠和C57中耳炎模型小鼠的ABR反應(yīng)閾均明顯高于其對(duì)照組，C57中耳炎模型小鼠的ABR反應(yīng)閾在click聲和短純音8、16 kHz有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且對(duì)click聲最為敏感(P<0.01)，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應(yīng)閾在click聲和短純音8、32 kHz差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同樣對(duì)click聲刺激最為敏感(P<0.01)。由表2可見，比較兩種中耳炎模型小鼠的實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應(yīng)閾高于C57中耳炎模型小鼠，在click聲和短純音8 kHz刺激聲下的ABR反應(yīng)閾差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且在click聲刺激下更有比較意義(P<0.001)。

表1 4組不同刺激聲下的ABR反應(yīng)閾耳)

與同鼠種對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；表3同

表2 TLR2-/-中耳炎模型和C57中耳炎模型的ABR反應(yīng)閾耳)

與C57小鼠實(shí)驗(yàn)組比較：1)P<0.01，2)P<0.001

2.34組小鼠click聲下的ABR各波潛伏期 如表3所示，TLR2-/-小鼠實(shí)驗(yàn)組和C57小鼠實(shí)驗(yàn)組的Ⅰ波，Ⅱ波和Ⅳ波潛伏期均較其對(duì)照組延長，C57小鼠Ⅰ波和Ⅱ波潛伏期較其對(duì)照組延長更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。如圖2所示，為麻醉狀態(tài)下小鼠在click聲刺激下的ABR波形圖，量取4組小鼠在80 dB SPL強(qiáng)度下Ⅰ波，Ⅱ波和Ⅳ波的潛伏期。

圖2 click聲刺激下ABR各波形

組別波Ⅰ波Ⅱ波ⅣTLR2-/-小鼠實(shí)驗(yàn)組2.06±0.201)3.07±0.311)4.81±0.351)TLR2-/-小鼠對(duì)照組1.58±0.062.26±0.104.16±0.10C57小鼠實(shí)驗(yàn)組1.85±0.141)3.16±0.251)4.66±0.071)C57小鼠對(duì)照組1.76±0.082.80±0.134.57±0.11

3 討 論

本研究顯示向TLR2-/-小鼠和C57小鼠鼓室注射PGPS可以成功誘導(dǎo)中耳炎，內(nèi)鏡圖像顯示中耳有滲出液，說明中耳炎小鼠模型造模成功。兩種品系小鼠誘導(dǎo)后的中耳炎組ABR反應(yīng)閾均高于對(duì)照組，且都在低頻刺激click聲差異最明顯，這與臨床中耳炎的ABR聽力特點(diǎn)相符，低頻刺激下ABR閾值升高。這可能是由于中耳炎發(fā)生時(shí)分泌積液，黏稠的分泌物使聲音阻抗力增加，傳導(dǎo)力減弱，造成閾值升高。有趣的是，與C57中耳炎模型小鼠對(duì)比，TLR2-/-中耳炎模型小鼠的ABR反應(yīng)閾更高，聽力損失程度更嚴(yán)重。TLR2-/-小鼠是在C57小鼠的基礎(chǔ)上敲除TLR2基因的小鼠，說明TLR2基因缺陷的小鼠患中耳炎后聽力下降較正常小鼠更嚴(yán)重。這與上面提到的TLR2因子的缺失可能對(duì)聽力水平的降低造成影響有關(guān)。

TLRs是先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體及病原模式識(shí)別受體之一，在急性炎癥反應(yīng)細(xì)胞吞噬作用的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡中起重要作用〔6～8〕。TLR2是已經(jīng)克隆的TLR家族中表達(dá)范圍最廣，識(shí)別病原微生物種類最多的成員〔9〕。它可單獨(dú)或協(xié)同其他Toll樣受體家族成員完成對(duì)病原體相關(guān)分子模式的識(shí)別，觸發(fā)機(jī)體對(duì)致病微生物的級(jí)聯(lián)免疫應(yīng)答，尤其是針對(duì)細(xì)胞毒素的抗炎癥反應(yīng)具有重要的作用，已經(jīng)成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)〔10，11〕。TLR2作為Ⅰ型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在免疫炎癥反應(yīng)過程中起著至關(guān)重要的作用。最近的一項(xiàng)研究表明，在人類中耳炎患者的中耳黏膜組織中TLR2表達(dá)水平明顯降低〔12～14〕，TLR2信號(hào)可能在中耳炎感染中起著關(guān)鍵調(diào)控作用。TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要分為 2 條途徑：依賴髓樣分化因子(MyD)88途徑和非依賴MyD88途徑(也稱為依賴TRIF 途徑)〔15〕。TLR2可通過與相應(yīng)的配體結(jié)合形成二聚體復(fù)合物，并發(fā)生內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變，從而招募包括接頭蛋白MyD88、TIR相關(guān)蛋白、類MyD88樣分子、干擾素誘導(dǎo)連接蛋白、人易位關(guān)聯(lián)膜蛋白以及包含TIR 結(jié)構(gòu)域的分子蛋白(SARM)，然后啟動(dòng)下游的炎癥反應(yīng)〔16〕。但是TLR2 在炎癥相關(guān)性疾病中耳炎中的具體作用機(jī)制尚未清楚，有望進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，由于兩種品系中耳炎模型小鼠均在click聲刺激下最有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組中耳炎小鼠模型均在Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期延長。這可能是由于中耳積液時(shí)聲能傳導(dǎo)的阻抗變大，傳導(dǎo)至內(nèi)耳的聲能減少，故Ⅰ波、Ⅱ波潛伏期延長，臨床上經(jīng)常是以延時(shí)出現(xiàn)的Ⅰ波作為診斷中耳炎較好的指標(biāo)，這與臨床結(jié)果也是相符的。

中耳炎小鼠模型已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道和研究，但是關(guān)于中耳炎小鼠模型的聽力特點(diǎn)尚未有相關(guān)探討。本研究首次探討中耳炎小鼠模型的聽覺特點(diǎn)，對(duì)中耳炎小鼠模型的聽力損失程度及性質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，為臨床早期及時(shí)診斷中耳炎提供依據(jù)，尤其選擇TLR2-/-小鼠和C57小鼠這兩種品系的小鼠模型，意在探討TLR2因子的缺失與中耳炎的關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究中耳炎患病的分子機(jī)制，甚至將TLR2作為靶目標(biāo)，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，為中耳炎的防治開辟新途徑。