楊春強(qiáng) 相彬 路俊生 李明 張霞 王均志

(1日照市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東 日照 276800；2青島市城陽區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科)

冠心病(CHD)是一類復(fù)雜和多因素促成的疾病。發(fā)病年齡男性≤55歲，女性≤65歲，則稱為早發(fā)CHD(PCAD)。流行病學(xué)調(diào)查資料表明CHD已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家人群發(fā)病和死亡原因的主要疾病之一。近年來，我國CHD發(fā)病率、患病率、死亡率均呈上升趨勢〔1〕。人類血清對氧磷酶(PON)1由肝臟合成，相對分子質(zhì)量為43 kD，在血清中借助于極端疏水的N端和載脂蛋白A1緊密結(jié)合，固定于高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)中，因能水解有機(jī)磷酸酯的底物對氧磷而命名〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)PON1通過抑制低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的生成和水解氧化型的LDL-C，抑制巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔3，4〕。目前PON1基因多態(tài)性與CHD的相關(guān)性亦是研究的熱點(diǎn)。其中rs662位點(diǎn)引起編碼區(qū)192位的非同義氨基酸置換(谷氨酸→精氨酸)〔5〕，從而導(dǎo)致PON1水解活性的不同。這個(gè)192谷氨酸變體水解對氧磷的效率低于精氨酸變體可以有效地抑制LDL-C的氧化〔6〕。而192精氨酸變體的抗氧化能力降低可能與CHD的發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)〔7，8〕。吸煙是目前已知的可以降低CHD患者PON1活性的影響因素〔9〕，并且煙草提取物抑制PON1活性成劑量及時(shí)間依賴性〔10〕。因此，研究CHD患者PON1基因多態(tài)性-吸煙的交互作用將會在冠心病的一級預(yù)防、高危險(xiǎn)人群篩查中發(fā)揮重要的理論指導(dǎo)作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。然而PON1基因多態(tài)性-吸煙交互作用是否與CHD危險(xiǎn)性相關(guān)目前尚無統(tǒng)一觀點(diǎn)。本研究擬探討PON1基因多態(tài)性和吸煙的交互作用與中國漢族人群PCAD的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1研究對象 2014年6月至2017年6月日照市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科住院及門診PCAD患者688例及體檢中心無CHD病史的健康體檢者1 226例進(jìn)行基因分型。所有研究對象要求年齡男性≤55歲，女性≤65歲，并且均采用國際上公認(rèn)的診斷CHD的方法，并經(jīng)冠脈增強(qiáng)電子計(jì)算機(jī)斷層掃描或選擇性冠狀動(dòng)脈造影檢查，由?？漆t(yī)生進(jìn)行診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他心血管系統(tǒng)相關(guān)的疾??；②嚴(yán)重器質(zhì)性疾病史及嚴(yán)重感染史；③妊娠哺乳及長期服用避孕藥者。本研究中的研究對象均為無血緣關(guān)系漢族人。研究對象均知情同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2病史采集及實(shí)驗(yàn)室檢查 所有研究對象采集以下信息：年齡、性別、既往病史、藥物治療、CHD家族史、行為因素、體格檢查等情況。清晨取空腹靜脈血送至檢驗(yàn)科，常規(guī)進(jìn)行生化檢查。

1.3全血細(xì)胞基因組DNA的提取與分型 研究對象均抽取2 ml的外周靜脈血置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，采用北京天根科技公司(Tiangen Biotech，Beijing，China)的RelaxGene Blood DNA System提取所有樣本的基因組DNA。采用基于連接酶檢測反應(yīng)(LDR)的SNP分型技術(shù)(上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司)對所有樣本的4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。簡要流程如下：①通過多重PCR技術(shù)(Multiple PCR)獲得含有待檢測突變位點(diǎn)的基因片段；②通過多重LDR技術(shù)(Multiple LDR)進(jìn)行基因分型檢測；③最后通過測序儀電泳讀取檢測結(jié)果。

為了確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，我們在分型中使用了雙重陽性對照(相同DNA樣本的重復(fù))和陰性對照(空白，不含DNA 樣本)。SNP和樣本分型正確率在95%以上時(shí)方可進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)流程。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例(百分率)表示，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)量資料組間比較時(shí)，滿足正態(tài)性及方差齊性的數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)性及方差齊性者則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)使用χ2檢驗(yàn)以及基于二分類變量的Logistic回歸檢驗(yàn)。本研究采用廣義多因子降維法(GMDR)分析各種變量間的組合并判讀較好的模型。在一次性分析多個(gè)SNP是否與疾病相關(guān)聯(lián)時(shí)，如果將P值定義在0.05水平，則多重比較會增加假陽性結(jié)果，因此需要對此進(jìn)行校正，以減少假陽性的結(jié)果。主要應(yīng)用Bonferroni Correction法〔11〕進(jìn)行多重比較的校正。

2 結(jié) 果

2.1一般資料分析 兩組性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PCAD組的高血壓病史、糖尿病病史、吸煙史及家族史所占比例均明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組比較，PCAD組體重指數(shù)(BMI)及LDL-C水平明顯升高(P<0.05)，而HDL-C水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2對照組和PCAD組rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481等位基因和基因型頻率的分布 所有SNP位點(diǎn)均顯示出2個(gè)等位基因及3個(gè)基因型。rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481等位基因和基因型頻率分布在PCAD組和對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1 對照組與PCAD組一般資料分析

表2 對照組與CHD組基因型和等位基因頻率的分布〔n(%)〕

1)經(jīng)BonferroniCorrection法多重比較校正，下表同

2.3不同遺傳模型下(共顯性、顯性和隱性和加性模型)rs3735590、rs3917550、rs662，、rs3917481位點(diǎn)與PCAD的關(guān)聯(lián)分析 運(yùn)用基于二分類變量的Logistic回歸在不同遺傳模型下進(jìn)行所研究位點(diǎn)與PCAD的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示rs3735590位點(diǎn)在隱性模型 (TTvsCT+CC)下與PCAD相關(guān)(P=0.007 6，OR=0.23，95%CI=0.07～0.75)。在經(jīng)過多重校正后依然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030 4)。而rs3917550、rs662，、rs3917481在不同遺傳模型下均與PCAD遺傳易感性不相關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 不同遺傳模型下rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481位點(diǎn)與PCAD的關(guān)聯(lián)分析

共顯性模型：CT vs CC；TT vs CC(T)；顯性模型：TT+CT vs CC(T為最小等位基因)；隱性模型：TT vs CT+CC(T為最小等位基因)；加性模型：TT vs CT vs CC(T為最小等位基因)；P值：經(jīng)性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙史、家族史、BMI、HDL-C、LDL-C校正，下表同

2.4按照吸煙史分層后rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481與PCAD的關(guān)聯(lián)性分析及基因-吸煙的相乘的交互作用分析 因?yàn)閞s3735590、rs3917550及rs3917481的風(fēng)險(xiǎn)基因型頻率較少，同時(shí)，在大部分情況下，顯性模型也顯示了更好的適應(yīng)性。因此我們運(yùn)用基于二分類變量的Logistic回歸在顯性模型下進(jìn)行相乘的基因-吸煙交互作用分析。結(jié)果顯示rs3735590及rs662與吸煙存在相乘的交互作用(均P<0.000 1)。并且在按照吸煙史分層后，我們發(fā)現(xiàn)rs662位點(diǎn)的等位基因T(基因型為CT+TT)與吸煙的PCAD患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(P<0.05)。而rs3735590與有吸煙史及無吸煙史的PCAD患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均相關(guān)(均P<0.05)。其余兩個(gè)位點(diǎn)并未發(fā)現(xiàn)與PCAD的相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 按照吸煙史分層后rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481與PCAD的關(guān)聯(lián)性分析及基因-吸煙間的交互作用

2.5rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481與吸煙的相加的基因-吸煙交互作用分析 本研究同樣在顯性模型下進(jìn)行相加的基因-基因交互作用分析。我們使用2×2的析因設(shè)計(jì)來計(jì)算相加的基因-基因交互效應(yīng)。假設(shè)A(-)為非風(fēng)險(xiǎn)基因型，則A(-)/A(-)為參照組，RR11為A(+)/A(+)組風(fēng)險(xiǎn)/參照組的風(fēng)險(xiǎn)(OR值)，RR10為A(+)/A(-)組風(fēng)險(xiǎn)/參照組的風(fēng)險(xiǎn)，RR01為A(-)/A(+)組風(fēng)險(xiǎn)/參照組的風(fēng)險(xiǎn)。表5為不同位點(diǎn)組合下計(jì)算的RR11，RR10和RR01。如rs3735590/吸煙-0/0表示CC-無吸煙史組合；rs3735590/吸煙-0/1表示CC-有吸煙史組合；rs3735590/吸煙-1/0表示CT+TT-無吸煙史組合；rs3735590/吸煙-1/1表示CT+TT-有吸煙史組合。結(jié)果顯示調(diào)整混雜因素后，并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的交互作用效應(yīng)。

2.6rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481基因-吸煙交互作用的GMDR分析 本研究通過GMDR0.9軟件進(jìn)行多因子降維分析2.6rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481基因-吸煙交互作用。表6列出了不同組合的最佳模型，及訓(xùn)練精確度、測試精確度及10次擬合的交叉驗(yàn)證一致性(CV)。結(jié)果顯示rs3735590-rs3917550-rs662-rs3917481-吸煙構(gòu)成的組合符號檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，且訓(xùn)練精準(zhǔn)度、測試精準(zhǔn)度及CV都較高，因此為最佳交互作用模型。

表5 rs3735590、rs3917550、rs662、rs3917481與吸煙交互作用叉生分析(n)

吸煙0/1：無吸煙史/有吸煙史；rs3735590 0/1：CC/CT+TT；rs3917550 0/1：GG/GA+AA；rs662 0/1：CC/CT+TT；rs3917481 0/1：CC/CT+TT

表6 基因-吸煙交互作用和PCAD風(fēng)險(xiǎn)的廣義多因素降維模型

3 討 論

PCAD病理學(xué)研究表明其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊富含脂質(zhì)泡沫細(xì)胞，為軟斑塊〔12〕，此種軟斑塊進(jìn)展迅速易破裂是冠狀動(dòng)脈血栓形成的主要原因，故PCAD多無先兆癥狀，急性起病多表現(xiàn)為急性冠脈綜合征，尤其是急性心肌梗死，病死率極高〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，典型的PCAD患者多為超重、重度吸煙、血壓升高并且一級親屬多有CHD病史的患者〔14〕。與本研究結(jié)果類似。

吸煙是目前公認(rèn)的可引起過早死亡的最為重要的因素，并且為CHD的關(guān)鍵獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果與其他在東亞裔人群中的研究相似〔15〕，在整體人群中本研究并未發(fā)現(xiàn)PON1基因rs662位點(diǎn)的多態(tài)性與PCAD相關(guān)。然而，在按照吸煙史分層后，我們發(fā)現(xiàn)等位基因T(基因型為CT+TT)增加了吸煙PCAD患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，HDL-C參與了PONI基因?qū)HD發(fā)病的過程〔16〕，rs662位點(diǎn)的C等位基因與較低的HDL-C水平相關(guān)。然而，與他人研究結(jié)果一致〔17〕，我們并未發(fā)現(xiàn)PON1基因與HDL-C的相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，本研究說明PON1的rs662位點(diǎn)與吸煙的交互作用對PCAD的影響并非是由HDL-C等常見的危險(xiǎn)因素介導(dǎo)的。

此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的位點(diǎn)rs3735590與吸煙的交互作用或許參與了PCAD的發(fā)病。rs3735590位點(diǎn)位于PON1基因的3′非翻譯區(qū)(UTR)。研究顯示該位點(diǎn)的等位基因C到T的改變，可以降低miRNA-616對PON1基因3′UTR的親和力，從而促進(jìn)該基因的表達(dá)，并降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)〔18〕。本研究與以上研究相似，本研究結(jié)果提示TT基因型或許可以降低PCAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，我們發(fā)現(xiàn)對于有吸煙史的PCAD患者，攜帶等位基因T (基因型為CT+TT)或許降低了43%的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而，在無吸煙史的PCAD患者中，我們發(fā)現(xiàn)了等位基因T似乎增加了PCAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于后者為邊界P值，這種現(xiàn)象很難理解，或許可以解釋為吸煙與該位點(diǎn)的基因-環(huán)境之間的上位性效應(yīng)弱化了單個(gè)位點(diǎn)的等位基因或基因型的效應(yīng)。因?yàn)槟壳皟H有關(guān)于煙草提取物通過修飾PON1的自由巰基而改變血漿中該酶活性的生物學(xué)研究，卻罕見關(guān)于吸煙與PON1基因多態(tài)性交互作用的分子生物學(xué)研究。因此，未來需要更多的體內(nèi)及體外研究加以證實(shí)。

復(fù)雜疾病的發(fā)生往往涉及到多個(gè)基因的交互作用，基因之間、基因與環(huán)境之間也存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。因?yàn)闆]有最好的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來檢驗(yàn)基因-基因、基因環(huán)境交互作用，本研究結(jié)果Logistic回歸分析結(jié)果說明兩個(gè)位點(diǎn)rs373559與rs662與吸煙的交互作用是非依賴性的。傳統(tǒng)的Logistic回歸分析方法可用于基因間交互作用的研究，但是對于多變量的研究對象，交互作用也隨之增加，出現(xiàn)所謂的超參數(shù)化，從而降低檢驗(yàn)效能。因此，多因子降維分析法(MDR)應(yīng)運(yùn)而生，在基因交互分析中得到了廣泛應(yīng)用。MDR是一種非參數(shù)、無需遺傳模式的分析方法，它的主要特點(diǎn)是把高維的位點(diǎn)組合分成高危和低危兩類，降低了數(shù)據(jù)的維數(shù)，并通過交叉驗(yàn)證來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?。最后得到的結(jié)果是一組模型，每一個(gè)模型是從一個(gè)特定交互級別(l階、2階、…交互作用)中選取最優(yōu)的。該方法不僅適用于病例對照的研究設(shè)計(jì)，而且可應(yīng)用于復(fù)雜疾病的交互作用分析。以MDR方法為基礎(chǔ)，學(xué)者發(fā)展了GMDR。與MDR相比較，GMDR采用基于廣義線性回歸的積分的統(tǒng)計(jì)方法，代替了MDR中的高危和低危分類，可處理計(jì)量和計(jì)數(shù)資料，同時(shí)允許調(diào)整協(xié)變量。這種方法和MDR丟失大量信息的降維方法不同，從而把握度也得到提高。本研究結(jié)果顯示rs3735590-rs3917550-rs662-rs3917481-吸煙構(gòu)成的組合符號檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，且訓(xùn)練精準(zhǔn)度、測試精準(zhǔn)度以及交叉一致性都較高，因此為最佳交互作用模型，與PCAD發(fā)病有關(guān)，它們之間的調(diào)控機(jī)制可能參與了PCAD疾病的發(fā)展進(jìn)程，然而值得注意的是GMDR分析只是產(chǎn)生假說，這些推測都需要得到進(jìn)一步的證實(shí)。

本研究尚存在一些不足之處。①未能將這四個(gè)位點(diǎn)與血漿PON1活性做進(jìn)一步分析。盡管如此，前人的一些研究或許能支持我們的結(jié)論。②未能進(jìn)一步分析PCAD患者PON1基因多態(tài)性與吸煙嚴(yán)重程度的交互作用。因?yàn)榍耙咽黾?，煙草提取物抑制PON1活性成劑量及時(shí)間依賴性。因此，未來需要進(jìn)一步的研究，例如按照 “年支”劃分吸煙的分嚴(yán)重程度加以證實(shí)PON1基因與吸煙在PCAD患者中的交互作用效應(yīng)。

綜上，本研究從表觀遺傳學(xué)的角度分析了PON1基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)與吸煙的交互作用對PCAD的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)rrs3735590和rs662與吸煙存在交互作用，或許參與了PCAD的發(fā)病機(jī)制。因此，本研究或?yàn)閺幕颦h(huán)境交互作用的角度研究若干相關(guān)基因與PCAD的關(guān)系提供了新的研究方向。