原發(fā)性肝癌（PHC）是臨床常見的惡性腫瘤，主要包括肝細胞癌、肝內膽管細胞癌和肝細胞癌-肝內膽管細胞癌混合型等不同病理類型，其中肝細胞癌（HCC）占90%以上。我國的肝癌發(fā)病率占全世界肝癌的55%，而我國死于肝癌的人數占全世界死于該疾病的45%[1]。PHC具有起病隱匿、癥狀不明顯、進展迅速等特點，很多PHC患者因得到確診治療時已經達到局部晚期或已經發(fā)生遠處轉移，從而失去了外科手術治療的最佳時機。目前化療藥物的副作用比較大，對器官和細胞的選擇性較小，殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞也有極大傷害，治療并不能取得很好的臨床療效，致使肝癌患者有較高的復發(fā)率，較易發(fā)生轉移。我們通過分析32例肝細胞癌患者病情，利用免疫組化技術及RT-PCR技術檢測FHL2在肝細胞癌中的表達情況。初步探討FHL2在肝細胞癌中可能發(fā)揮的作用，觀察其對肝細胞癌生物學行為的影響，分析FHL2與肝細胞癌的相關性及其作用機制，為了探索肝癌基因治療合適的靶位，我們對轉錄因子FHL2在肝癌中的表達情況進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇我院32例肝細胞癌患者，手術前均未接受放療和化療，送檢時間為2011年1月～2013年12月。其中男18例，女14例；年齡45～79歲，平均（54.6±3.6）歲。依原發(fā)性肝癌的TNM分期（2010年UICC/AJCC國際分期）和腫瘤直徑是否大于5cm將32例患者分為兩組，分別為A組（Ⅰ期+Ⅱ期），腫瘤直徑≤5cm，B組（Ⅲ期+Ⅳ期），腫瘤直徑＞5cm，每組16例。兩組患者分別按性別、年齡、是否感染乙型肝炎病毒三項指標進行比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較[n（%）]

1.2 實驗試劑RNAiso Reagent購自Takara公司，胰蛋白酶購自Merk公司，Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒購自北京Invitrogen公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，EDTA、DAB購自福州邁新生物技術有限公司，全自動免疫組化儀配套試劑、全自動免疫組化儀二抗、全自動免疫組化儀購自羅氏公司，FHL2鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 組織處理 ①取組織塊剪碎后加入胰酶，通過離心后收集肝癌細胞置于培養(yǎng)瓶中；②吸棄培養(yǎng)基后在收集的肝癌細胞中加入RNAiso Reagent，吸取含肝癌細胞的裂解液至離心管中，隨后在室溫下靜置 5min。4℃條件下 12 000r/min 離心 15min；③吸取上清液轉移至另一支新的離心管中，向上清液中加入等體積（1/5體積的RNAiso Reagent）的異丙醇，充分混勻后室溫下靜置10min；④在4℃條件下12 000r/min離心10min，離心后觀察試管底部，可見沉淀。向沉淀中加入75%的乙醇1ml，然后4℃條件下12 000r/min離心5min，并盡量徹底地棄去乙醇。室溫條件下干燥沉淀5min，然后加入適量的RNasefree水并充分溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 RNA濃度測定 ①將核酸蛋白分析儀打開，調整屏顯稀釋倍數為50，預熱30min；②用三蒸水清洗比色杯3次，并用三蒸水調零；③向比色杯中加入98μl雙蒸水，接著加入2μl待測樣本，輕輕混勻后放入核酸蛋白分析儀中。共讀數3次，然后取平均值。

1.3.3 免疫組化 ①石蠟切片厚度為3～5μm；②在60℃恒溫烤箱中烘烤60min；③二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中依次脫蠟，每缸5min；④依次無水乙醇Ⅰ1min、無水乙醇Ⅱ 30s、95% 乙醇 30s、85% 乙醇 30s、75%乙醇30s脫去二甲苯至蒸餾水沖洗；⑤0.01M（pH 7.2）磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 3次，每次 5min；⑥室溫下3%雙氧水阻斷10min，PBS洗滌3次，每次5min；⑦抗原修復：加入EDTA緩沖液放置于微波爐中在10檔3min，高壓鍋沸水浴7min，溫水孵育30min，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5min；⑧棄多余的液體，10%山羊血清封閉，放置30min；⑨棄去多余血清，滴加一抗后，置于4℃冰箱中過夜；⑩37℃復溫半小時，PBS洗滌3次，每次5min；滴加二抗，在室溫下孵育30min，PBS洗滌3次，每次5min；DAB顯色：加入充分混勻新鮮配制的DAB溶液，使其顯色3～10min；PBS反復洗滌3次，每次5min；放入蘇木素中復染細胞核1min，用自來水充分沖洗后，投入鹽酸-乙醇分化液中分化胞漿3s，藍化；依次投入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ脫水后，投入二甲苯透明，使用中性樹膠封固。

1.4 結果分析抗體免疫組化定位后，通過光學顯微鏡觀察，并拍照記錄。所有照片均使用同一光學顯微鏡（BX51型，日本OLYMPUS公司生產）在相同條件下拍攝，因此消除了實驗誤差。拍攝過程中要保持穩(wěn)定的顯微鏡光源亮度，在固定的曝光時間內拍照，其中曝光度選擇在最高亮度值230附近。對于抗體表達陽性的區(qū)域，即照片顯示有黃色或棕黃色的區(qū)域累積光密度（IOD SUM）及目標區(qū)域面積使用 Image-pro plus6.0（IPP6.0）軟件測定，每一例經免疫組化定位的病理切片選擇5個400×視野進行拍照并認真分析，之后由IPP導入Excel表格，并依此計算平均光密度值（mean density），計算公式為平均光密度=IOD SUM/目標區(qū)域面積，最后將每個病例5個400×視野的平均光密度值的均值作為免疫組化的分析結果。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。組織標本FHL2 mRNA表達水平的實時熒光PCR結果進行Mann-Whitney U檢驗，所有的檢測均選擇雙尾檢驗且通過 SigmaStat 3.1 軟件（Systat Software，Inc，Richmond，CA）實現。

2 結果

2.1 FHL2表達與肝癌進展分期的相關性

2.1.1 RT-PCR結果 患者肝癌組織中FHL2有少量表達，A組和B組肝癌組織中FHL2的mRNA相對表達量顯著高于對應癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2 mRNA相對表達量（±s）

表2 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2 mRNA相對表達量（±s）

注：P為分別與癌旁組織比較

分組 n FHL2 mRNA 相對表達量 P A組 161.56±0.0740.048 B組 161.38±0.0430.025癌旁組織 320.43±0.065

2.1.2 免疫組化結果 患者肝癌組織中有FHL2的表達，并且胞漿及胞核中均有表達，A組患者肝癌組織FHL2的表達高于B組，癌旁組織中幾乎沒有表達。見表3、圖1。

表3 兩組患者肝癌及癌旁組織FHL2表達平均光密度值

圖1 肝癌及癌旁組織中FHL2免疫組化結果（400×）

2.2 FHL2表達與肝癌臨床療效相關性免疫組化結果顯示，FHL2在經手術及化療后緩解或未緩解患者的肝癌細胞核及胞漿中均有表達，病情緩解患者肝癌細胞中FHL2的表達高于經治療病情穩(wěn)定或進展患者。見圖2、表4。

圖2 兩組患者肝癌組織中FHL2免疫組化結果（400×）

表4 不同預后患者肝癌及癌旁組織表達FHL2平均光密度值（±s）

表4 不同預后患者肝癌及癌旁組織表達FHL2平均光密度值（±s）

預后 n FHL2平均光密度值 P病情緩解患者 160.42±0.0230.00病情穩(wěn)定或進展患者 160.27±0.042

2.3 FHL2表達與肝癌患者是否感染肝炎病毒相關性RT-PCR結果顯示，患者肝癌組織中有少量的FHL2表達，A組患者肝癌組織FHL2的表達高于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組組內感染乙型肝炎病毒與未感染病毒患者肝癌組織中FHL2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 兩組感染與未感染乙型肝炎病毒患者肝癌組織中FHL2的mRNA相對表達量

3 討論

原發(fā)性肝癌常見組織病理學類型包括肝細胞癌（hepatic celluler cancer，HCC）、肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和肝細胞癌 -肝內膽管細胞癌混合型，其中HCC占90%以上，多數患者確診時已是晚期或發(fā)生遠處轉移，失去外科手術治療的機會。因此，人們對新的治療方法如基因治療、免疫治療、靶向腫瘤干細胞治療等生物治療手段的關注越來越多[2]。

轉錄因子FHL2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均有非常重要的作用。FHL2是LIM蛋白家族LIM-only亞類中的成員，LIM蛋白是有一個或多個LIM結構域且可參與調節(jié)蛋白與蛋白之間相互作用的蛋白質[3]。FHL2蛋白在不同組織的細胞分化及惡性腫瘤的發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用，鑒于不同的腫瘤細胞類型，轉錄因子FHL2發(fā)揮著轉錄協(xié)同因子的作用，能促進或抑制腫瘤的生長[4，5]。與正常肝組織相比，肝母細胞瘤中FHL2 mRNA有較高水平的表達，β-catenin是該瘤常見的突變體，與FHL2一樣，是共活化物β-catenin/TCF/LEF介導的轉錄，參與肝母細胞瘤的形成，β-catenin有增強轉錄的功能[6～8]。研究發(fā)現，過量表達FHL2基因的多種細胞株中其均能誘導細胞凋亡[9～11]。FHL2蛋白在FHL家族中研究最為深入，以體外實驗為主，并且發(fā)現FHL2蛋白能與50多種蛋白相互作用[12]，通過有選擇地使用LIM結構域的不同區(qū)域，參與不同細胞的信號通路而發(fā)揮其生物學功能。FHL2已被證實參與多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。實驗表明FHL2在許多組織的細胞分化及癌癥發(fā)生方面有重要作用，它能發(fā)揮轉錄共調節(jié)因子的功能，是雄激素受體（androgen receptor，AR）、激活蛋白 l（activatorprotein 1，AP-1）、cAMP 響應元件結合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）及胰島素樣生長因子結合蛋白（insulin-like growth factorbinding protein 5，IGFBP-5）等多種轉錄因子的共調節(jié)因子；它參與調控器官的發(fā)育、細胞的分化、染色質的重建、細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。研究表明，FHL2基因表達可以誘導腫瘤細胞的分化，抑制其生長[15]。

本研究采用免疫組化法及RT-PCR法檢測不同臨床分期患者肝癌組織的FHL2表達情況，比較不同臨床分期患者FHL2表達的差異。肝癌及癌旁組織RT-PCR結果顯示，臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織FHL2的表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁組織表達量很低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。免疫組化結果顯示，FHL2在胞核及胞漿中均有表達。臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織FHL2的表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者，癌旁組織基本沒有表達。經平均光密度值檢測，結果顯示臨床分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織表達FHL2確實高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。癌旁組織內FHL2的表達很低，與腫瘤組織表達FHL2比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。有研究表明，FHL2在肝癌組織中的表達明顯下調，其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[16]。根據本研究免疫組化及RT-PCR結果，FHL2在肝癌臨床分型為Ⅰ期和Ⅱ期的患者肝癌組織中表達高于臨床分期為Ⅲ期和Ⅳ期的患者，提示FHL2在肝癌中主要起抑制作用，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中低表達，Ⅲ期和Ⅳ期患者的肝癌病情進展更快。

免疫組化顯微鏡下觀察顯示經手術及化療治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者。經平均光密度值檢測，結果顯示治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。FHL2在肝癌組織中起抑制作用，治療緩解患者肝癌組織FHL2表達高于治療后病情穩(wěn)定或進展患者，說明緩解患者高表達的FHL2能夠抑制肝癌的進一步發(fā)展，因此治療后療效更好。在肝癌的基因治療中，可以考慮促進FHL2的表達以抑制肝癌病情的發(fā)展，也可以將肝癌組織中FHL2的表達量作為預測肝癌療效的指標。

RT-PCR結果顯示，Ⅰ期和Ⅱ期感染與未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Ⅲ期和Ⅳ期感染與未感染乙型肝炎病毒患者FHL2表達差異也無統(tǒng)計學意義（P>0.05），感染乙型肝炎病毒的Ⅰ期和Ⅱ期肝癌患者FHL2表達高于Ⅲ期和Ⅳ期患者（P<0.05）。說明是否感染乙型肝炎病毒對肝癌組織表達FHL2并無影響。因此，轉錄因子FHL2在肝細胞癌組織中的表達與進展分期及臨床療效有明顯的相關性，可以作為肝細胞癌分期的輔助診斷標準及預測臨床療效的指標，并且可以作為肝癌基因治療的新靶點，值得臨床推廣應用。