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        N-乙酰轉(zhuǎn)移酶8在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

        2019-11-27 06:32:42
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        腎癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,起源于腎實(shí)質(zhì)小管上皮系統(tǒng),約占人類全部惡性腫瘤的2%~3%,通常又被稱為腎細(xì)胞癌[1,2]。RCC約占腎臟腫瘤的90%,其病理類型有多種,其中80%為腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)[3]。RCC 的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多基因共同作用的過程,其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與個(gè)體對(duì)內(nèi)、外源性有害物質(zhì)代謝解毒活性的遺傳變異有關(guān),人體攝入大多數(shù)外源性致癌物后,需經(jīng)過體內(nèi)代謝激活才能損傷DNA,引起基因突變從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[4]。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N acetyltransferases,NAT)是人體內(nèi)重要的致癌物滅活酶,其中NAT8(N-乙酰轉(zhuǎn)移酶8)是蛋白質(zhì)編碼基因,為NAT家族重要成員之一,作為一種微粒體酶,僅在人的腎臟和肝臟中表達(dá),被認(rèn)為在腎臟和肝臟結(jié)構(gòu)及功能的發(fā)育和維持中發(fā)揮重要作用[5]。NAT8可以乙?;腚装彼酳-綴合物的游離α-氨基形成硫酸,還可以通過乙酰化和調(diào)節(jié)PROM1的表達(dá)來調(diào)節(jié)凋亡[6,7]。2011年1月~2014年12月和 2016年9月~2017年2月我們分別檢測(cè)42例CCRCC患者腫瘤及瘤旁組織中NAT8蛋白的含量以及12例CCRCC患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織中NAT8 mRNA含量,分析NAT8與CCRCC病理分期、腫瘤分級(jí)以及患者臨床特征的關(guān)系,探討NAT8與CCRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 研究對(duì)象

        1.1.1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)組 12例患者術(shù)后病理均證實(shí)為CCRCC。5例行腎癌根治術(shù),7例行保留腎單位腎腫瘤切除術(shù);男7例,女5例;右腎腫瘤8例,左腎腫瘤 4例;年齡 18~80歲,平均(55.3±9.5)歲;腫瘤直徑大小 1.0~10.0cm,平均(5.0±2.1)cm;高分化1例,中分化10例,低分化1例;T1期11例,T2期1例。

        1.1.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)組 42例患者術(shù)后病理均證實(shí)為CCRCC。42例均行腎癌根治術(shù);男22例,女20例;年齡18~80歲,平均(53.7±10.4)歲,其中≤54歲者22例,>54歲者20例;腫瘤直徑大小2.0~10.0cm,平均(5.8±1.9)cm,其中≤7cm 31例,>7cm 11例;TNM 分期:Ⅰ期31例,Ⅱ期11例,無Ⅲ及Ⅳ期患者;參照Fuhrman分級(jí)[1]:高分化25例,中分化17例,無低分化患者。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)組 取組織樣本75mg,Trizol法提取RNA,使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性,Random primer擴(kuò) 增 RNA,NAT8引 物 設(shè) 計(jì) 為 F:5'-CAAGCCCCAGACGGTATCTC-3';R:5'-TCCT GGTATTTGCGGATGTGA-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 190bp。內(nèi)參β-actin(Human)引物設(shè)計(jì)為F:5'-AGCACAGAG CCTCGCCTTTG-3',R:5'-CTTCTGACCCATG CCCACCA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度208bp。熒光PCR擴(kuò)增,依次按照 95℃ 10s、60℃ 60s、95℃ 15s順序,并從60℃緩慢加熱到99℃(+0.05℃/s,期間收集熒光),以此建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線。各樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng),采用ΔΔCт的相對(duì)定量:儀器直接生成各樣品目的基因和內(nèi)參基因的Cт值。將每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其內(nèi)參基因的濃度,所得出的數(shù)值即為此樣品此基因校正后相對(duì)含量。

        1.2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)組 免疫組化染色法測(cè)定42例CCRCC腫瘤及瘤旁組織標(biāo)本NAT8蛋白,收集腫瘤及癌旁組織(癌旁組織為距離腫瘤1cm以上的腎組織),手術(shù)切除標(biāo)本后立即置入40%甲醛溶液中固定48~72h。參照MaxVisionTM/HRP即用型試劑盒操作說明書進(jìn)行免疫組化染色,包括脫蠟、水化,抗原修復(fù),加一抗(兔抗人 NAT8多克隆抗體,購(gòu)自Abcam公司),加二抗(即用型MaxVisionTM /HRP免疫組化試劑盒,購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),顯色,復(fù)染,脫水、封片。采用免疫組織化學(xué)Volm判斷標(biāo)準(zhǔn),0分為陰性(-),1~2分為弱陽性(+),3~4分為陽性(++),5~6分為強(qiáng)陽性(+++)。陰性和弱陽性視為低表達(dá)狀態(tài),陽性和強(qiáng)陽性視為高表達(dá)狀態(tài)。所有標(biāo)本的IHC切片交由兩位病理專家獨(dú)自審閱,分別給出各自結(jié)論,當(dāng)兩位專家意見無法統(tǒng)一時(shí),再請(qǐng)第三位病理學(xué)專家獨(dú)立給予判別。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例比較,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)組12例CCRCC患者新鮮腫瘤組織及癌旁組織行qRT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示CCRCC組織中NAT8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常腎組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003),見圖1。

        圖1 qRT-PCR檢測(cè)CCRCC與癌旁組織NAT8mRNA表達(dá)水平

        2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)組IHC染色結(jié)果顯示,42例患者腫瘤及癌旁正常組織標(biāo)本中NAT8均有不同程度的表達(dá)(見圖2),NAT8蛋白在腎癌中呈低表達(dá),癌旁正常腎組織中高表達(dá),腎癌及癌旁組織中低表達(dá)率分別為 60%(25/42)、12%(5/42),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.741,P<0.001)。

        圖2 免疫組化檢測(cè)CCRCC組織中NAT8表達(dá)水平

        42例CCRCC患者中,不同年齡、性別患者癌組織中NAT8表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.952、P=0.187);不同腫瘤直徑、腫瘤分期及分級(jí)患者癌組織中NAT8表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

        42例CCRCC患者中,隨訪25例,失訪17例。隨訪12個(gè)月結(jié)果:無死亡患者,1例帶瘤生存,為低表達(dá);24例無瘤生存,分別為9例高表達(dá)、15例低表達(dá);隨訪24個(gè)月結(jié)果:1例死亡,為低表達(dá);6例帶瘤生存,2例為高表達(dá),4例低表達(dá);18例無瘤生存,分別為7例高表達(dá)、11例低表達(dá);隨訪36個(gè)月結(jié)果:2例死亡,均為低表達(dá),8例帶瘤生存,3例為高表達(dá),5例為低表達(dá);15例無瘤生存,分別為6例高表達(dá)、9例低表達(dá)。死亡患者均為腫瘤組織NAT8低表達(dá)患者,腫瘤組織NAT8高表達(dá)CCRCC患者隨訪3年無一例死亡。

        表1 NAT8表達(dá)與CCRCC患者臨床特征的關(guān)系[n(%)]

        3 討論

        腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì),美國(guó)2016年新診斷腎癌患者62 700例,因腎癌死亡者 14 020例,診斷時(shí)中位年齡為64歲[8]。我國(guó)腎癌的發(fā)病年齡亦漸趨于年輕,發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì),每年確診為腎癌患者的比例約為男性37/10萬人群、女性16/10萬人群。常見惡性腫瘤中,近20年來腎癌的發(fā)病率上升速度最快[9],由于RCC臨床癥狀多變,目前對(duì)其早期診斷較為困難,尚無特異性方法,約1/4~1/3的患者入院診斷時(shí)已為中晚期;同時(shí),由于腎癌對(duì)放射治療及化學(xué)治療均不敏感,根治性手術(shù)切除為早期腎癌患者的主要治療方式,然而術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然可能高達(dá)20%[10]。因此,臨床上對(duì)不同腎癌患者預(yù)后的合理預(yù)測(cè)將有助于改善其治療效果。

        目前,腎癌的組織學(xué)類型主要有10個(gè),包括透明腎細(xì)胞癌、多房囊性透明腎細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌Ⅰ型和Ⅱ型、嫌色腎細(xì)胞癌、Bellini集合管癌、腎髓樣癌、Xp11易位性腎癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤伴發(fā)癌、黏液性管狀及梭形細(xì)胞癌及尚未分類的腎細(xì)胞癌[3]。其中最常見的組織學(xué)類型是透明腎細(xì)胞癌,占腎癌總數(shù)的70%~90%[11]。手術(shù)為早期CCRCC有效的治療方法,然而術(shù)后一旦發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。目前臨床上將癌腫的直徑大小、組織學(xué)類型、Fuhrman分級(jí)、腫瘤分期、腫瘤壞死、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微血管浸潤(rùn)等用來預(yù)測(cè)腎癌術(shù)后的預(yù)后情況,然而臨床報(bào)道差異較大,且尚無理想的單一臨床因素可以預(yù)測(cè)腎癌患者的預(yù)后。

        近年來,隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)越來越多的蛋白標(biāo)記物與CCRCC發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。它們的發(fā)現(xiàn)不僅有助于評(píng)估CCRCC患者的預(yù)后,同時(shí)也有助于臨床醫(yī)生明確 RCC患者的診斷、預(yù)判其術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,并可能成為新的靶點(diǎn),用于分子靶向藥物的研發(fā)及CCRCC患者的治療[12]。NAT8為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員之一,其功能是催化乙?;鶊F(tuán)從乙酰輔酶A(CoA)到芳香胺和酰腙等雜環(huán)胺類物質(zhì),在某些藥物代謝、致癌物質(zhì)滅活或活化過程中都起著重要的作用。NAT8在正常的肝及腎組織中高表達(dá)[13]。Zand等[14]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中NAT8及其代謝產(chǎn)物N-乙酰天冬氨酸(NAA)表達(dá)水平與患者總體生存期具有相關(guān)性,且靶向干擾NAT8可下調(diào)FOXM1、降低腫瘤細(xì)胞活力。Lou等[15]在非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)中發(fā)現(xiàn),通過siRNA下調(diào)NAT8可抑制NSCLC細(xì)胞的NAA產(chǎn)生,提示NAT8在非小細(xì)胞肺癌中的作用可能與其代謝物NAA密切相關(guān)。然而,目前NAT8在腎癌方面的研究報(bào)道較少。在本研究中,我們檢測(cè)了NAT8在CCRCC組織及癌旁正常腎組織中的表達(dá)。采用免疫組化法檢測(cè)42例CCRCC腫瘤組織及癌旁正常腎組織中NAT8的表達(dá),結(jié)果顯示在正常腎組織及CCRCC組織中均可見陽性表達(dá)。然而,在正常腎組織中,NAT8以高表達(dá)為主,而CCRCC組織中NAT8以低表達(dá)為主。我們進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAT8在CCRCC中的表達(dá)水平明顯低于其配對(duì)的癌旁正常腎組織(P=0.003)。該結(jié)果表明NAT8的低表達(dá)可能與CCRCC相關(guān)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NAT8表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分級(jí)及TNM分期相關(guān),其中,腫瘤直徑≥7cm患者中NAT8低表達(dá)患者比例明顯高于腫瘤直徑<7cm的腫瘤患者,中等分化患者中NAT8低表達(dá)患者比例高于高分化患者。Ⅱ期患者中NAT8低表達(dá)患者比例明顯高于I期患者。因此,我們認(rèn)為NAT8低表達(dá)與CCRCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。另外,本研究隨訪過程中有2例患者死亡,均為腫瘤組織NAT8低表達(dá)患者,但應(yīng)考慮腫瘤分期分級(jí)的影響及樣本量較少、隨訪時(shí)間短等因素。

        總之,本研究表明NAT8在CCRCC中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)水平與CCRCC的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。檢測(cè)NAT8表達(dá)量有望為CCRCC患者個(gè)體化治療及隨訪提供依據(jù),改善CCRCC患者預(yù)后。然而,因樣本量少、隨訪時(shí)間短、失訪率高等因素,NAT8低表達(dá)與CCRCC進(jìn)展的相關(guān)性以及與患者預(yù)后的相關(guān)性尚有待后續(xù)在細(xì)胞水平、動(dòng)物模型水平進(jìn)一步行功能及機(jī)制的相關(guān)研究。

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