高越穎， 劉 蕾， 任怡琳， 耿 燕

(江南大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

0 引 言

制藥工程專業(yè)是培養(yǎng)具有新藥研究與開發(fā)的基本能力、有較扎實的制藥工程設(shè)計基礎(chǔ)知識、并具有一定的研究、解決制藥工程實際問題能力的人才。我校制藥工程專業(yè)作為教育部特色專業(yè)、江蘇省品牌專業(yè)，在人才培養(yǎng)過程中，尤其注重學(xué)生綜合能力的培養(yǎng)。從人才培養(yǎng)方案、教學(xué)大綱及教學(xué)過程都突出了制藥企業(yè)對學(xué)生的實際需要，從新藥研發(fā)實際出發(fā)強化學(xué)生開放性思維的培養(yǎng)。藥理學(xué)作為專業(yè)核心課程之一，在江蘇省精品課程建設(shè)理念的基礎(chǔ)上，形成了“基礎(chǔ)-綜合-開放創(chuàng)新”層次鮮明的開放式實驗課程體系，藥理學(xué)設(shè)計性實驗主要目的是培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究能力和創(chuàng)新能力[1-3]。

以前期課程(如藥物化學(xué)實驗)中合成的產(chǎn)品或?qū)W院科研團(tuán)隊研究成果為研究對象，設(shè)置了藥效學(xué)評價、藥代動力學(xué)研究及毒性評價等研究方向，學(xué)生根據(jù)自己的擅長和興趣自愿組合，4或5人1組，查閱文獻(xiàn)、確定研究方向、設(shè)計實驗方案，老師組織學(xué)生對各組的實驗方案進(jìn)行科學(xué)性及可行性的論證，每個同學(xué)都參與討論。最后，根據(jù)實驗設(shè)計的水平和實驗室實際條件進(jìn)行篩選整合，形成1或2個可實施的設(shè)計性實驗。實驗結(jié)束后各小組整理實驗結(jié)果，進(jìn)行匯報分享，每個同學(xué)都要按國家標(biāo)準(zhǔn)論文格式寫一篇論文。通過開展設(shè)計性實驗，不僅能培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維，綜合運用理論知識及新藥研發(fā)能力[4-6]，也能夠為教師科研工作中開展藥物合成或工藝的改進(jìn)提供實驗依據(jù)。

1 實驗原理

藥食用真菌是世界公認(rèn)的具有良好療效的藥食同源物質(zhì)，靈芝發(fā)酵菌絲體粉(以下簡稱靈芝菌粉)是學(xué)院較成熟的科研成果，有抗氧化、抗毒性以及免疫調(diào)節(jié)的功效[7]，為探究其安全范圍，設(shè)計了急性毒性實驗，為促進(jìn)其合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

急性毒性是指動物一次或24 h內(nèi)多次接受一定劑量的受試物，動物在短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。傳統(tǒng)的急性毒性以動物死亡為判斷指標(biāo)，與動物保護(hù)的“3R”原則嚴(yán)重沖突，而且對于毒性較低的受試物為求出LD50動物使用量大、死亡率高，故本研究應(yīng)用固定劑量法，對其毒性表現(xiàn)進(jìn)行觀察[8-10]。通過實驗學(xué)生能夠直觀觀察到不同劑量下靈芝菌粉是否存在毒性表現(xiàn)，還可通過血清生化指標(biāo)、主要器官的病理切片驗證其毒性。

2 試劑及儀器

藥品與試劑：靈芝菌粉為靈芝發(fā)酵的菌絲體經(jīng)噴霧干燥后得到的粉末。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗動物：健康ICR小鼠，SPF級，40只，體重(20±2)g，由揚州大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度55%。

儀器：艾本德5810R離心機，德國Eppendorf 公司；科華卓越310全自動生化分析儀，上?？迫A生物工程股份有限公司；KD-BM生物組織包埋機，浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；KD-BL包埋冷凍臺，浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；YT-6C生物組織攤烤片機，湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；LEICA RM2135切片機，德國LEICA 公司；Olympus BX41生物顯微攝影系統(tǒng)，日本Olympus公司。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組及給藥

小鼠隨機分成靈芝菌粉4個劑量(50、500、2 000、5 000 mg/kg)組[11]，另設(shè)對照組，每組8只，雌雄各半且分籠飼養(yǎng)。靈芝菌粉各組一次性灌胃(ig)給予相應(yīng)藥物水溶液，給藥前禁食4 h，自由飲水，給藥體積10 mL/kg。對照組小鼠ig等體積蒸餾水。

3.2 一般狀態(tài)觀察

給藥后觀察小鼠的外觀，包括皮毛、呼吸、鼻眼、口腔有無異常分泌物等，觀察小鼠的精神狀態(tài)，大、小便等情況；各劑量組小鼠觀察不以死亡為指標(biāo)，而以明顯的毒性反應(yīng)為指標(biāo)。詳細(xì)觀察給藥后4 h內(nèi)小鼠反應(yīng)情況，然后每天上午、下午各觀察一次，連續(xù)觀察14天[12-13]。

3.3 指標(biāo)測定

小鼠給藥后14天后頸椎脫臼法處死小鼠，摘眼球取血，進(jìn)行大體解剖肉眼觀察有無明顯病變，并取腦、胸腺、心、肝、脾、腎等臟器稱質(zhì)量，計算臟體比，臟體比=器官重/小鼠體重 ×100%。血液室溫靜置1 h后，3 000～4 000 r/min離心，取上清，-20℃保存，用于生化指標(biāo)測定。血清AST，ALT采用全自動生化分析儀進(jìn)行分析[14-15]。

3.4 重要臟器形態(tài)學(xué)觀察

小鼠給藥后14天，脫頸致死，速取心、腦、肺、肝、脾、腎新鮮組織，于10%福爾馬林固定，常規(guī)浸蠟包埋5 μm切片，切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅(Hematoxylin- Eosin，HE)染色[16]。

3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

4 實驗結(jié)果

4.1 各劑量組小鼠一般觀察

給藥后各劑量組小鼠體型正常，背不弓起，行動迅速，被毛濃密有光澤，呼吸正常，食欲良好，糞便顏色、質(zhì)地正常。外觀形態(tài)與對照組無區(qū)別。

4.2 小鼠臟體比

靈芝菌粉一次性給藥14天后，各劑量組各器官外觀顏色、大小均正常，未見明顯萎縮、水腫、滲出、增生等病變。各劑量器官指數(shù)與對照組比較均無顯著差異(見表1)。

表1 靈芝菌粉對小鼠器官指數(shù)的影響

4.3 小鼠血清生化指標(biāo)

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST或GOT)和丙氨酸氨基氨酶(ALT或GPT)合稱轉(zhuǎn)氨基酶，肝受損后，內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶釋放到細(xì)胞外，使得血清中的轉(zhuǎn)氨酶水平成為肝臟損傷的重要指標(biāo)[12]。與對照組相比，給藥后低劑量組小鼠血清AST、ALT均未出現(xiàn)顯著差異(見表2)?？梢婌`芝菌粉對小鼠血液生化指標(biāo)無明顯影響。

表2 靈芝菌粉對小鼠組織血清生化指標(biāo)的影響

4.4 主要臟器病理學(xué)檢查

對照組的心肌細(xì)胞正常，肝細(xì)胞輪廓清晰，可見核仁，中央靜脈完整，肺被膜完好，肺泡間隔內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤，腎組織結(jié)構(gòu)完整，腦組織皮層可見典型的椎體細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞排列整齊，高劑量組5 000 mg/kg小鼠的心、肝、肺、腎、腦切片染色后光鏡檢查結(jié)果也未見任何特異性病理改變。

綜上，靈芝菌粉在最高劑量5 000 mg/kg給藥時，小鼠生長良好，臟體比、血清生化指標(biāo)與對照組比均無顯著差異(P>0.05)，主要器官病理組織學(xué)檢查結(jié)果也表明靈芝菌粉對受檢臟器無明顯損害，因此有著良好的口服安全性。

5 結(jié) 語

靈芝孢子粉的急性毒性試驗是學(xué)生十分感興趣的選題，激發(fā)了學(xué)生的求知欲，從實驗設(shè)計到結(jié)果分析學(xué)生感到有較大的挑戰(zhàn)性，實驗技能得到了提高。通過文獻(xiàn)調(diào)研，學(xué)生對藥物急性毒性研究的基本概念、基本原則和主要研究內(nèi)容和實驗方法，有了較全面的學(xué)習(xí)；實驗實施過程中，小鼠灌胃、取血、解剖取材等實驗動物基本技能操作得到了復(fù)習(xí)鞏固，此外學(xué)生還接觸了血清生化測定、病理切片染色等多門學(xué)科綜合實驗技術(shù)技能，培養(yǎng)了動手實踐能力、創(chuàng)新意識及科研興趣。

當(dāng)然在設(shè)計性實驗過程中也發(fā)現(xiàn)了一些問題，例如：設(shè)計實驗方案時，很多學(xué)生沒有考慮到藥食用菌的低(無)毒，設(shè)計了LD50這個指標(biāo)；取血經(jīng)驗不夠，導(dǎo)致有些小鼠取血量偏少；取材過程中未將器官取完整造成實驗誤差，另外統(tǒng)計技能的缺乏也是學(xué)生進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的主要障礙。盡管本實驗還有一些不盡如人意的地方，但是通過實踐與摸索，該實驗將不斷完善。