楊麗華，徐香琴

(湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425199)

車前子為車前科車前屬植物車前(Plantagoasiatica L.)或平車前(P.depressa Willd.)的干燥成熟種子，性味甘寒，入腎、膀胱、肝、肺經(jīng)，具有利水通淋、滲濕止瀉、清肝明目、清熱化痰的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，車前子是一種非常豐富的自然資源，具有很高的藥用價(jià)值，主要化學(xué)活性成分包括黃酮類[2-5]、苯乙醇苷類[6-8]、環(huán)烯醚萜類[9]、多糖類[10-11]等，尤其是其中的黃酮類化合物。本文采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)永州車前子總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)不同采收時(shí)間的車前子中總黃酮的提取率進(jìn)行考察，確定車前子總黃酮的最佳采收時(shí)間，為車前子的采收時(shí)間提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

722-B紫外分光光度計(jì)，天津市普瑞斯儀器有限公司；JA3003電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)有限公司；SJB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：不同采收時(shí)間的車前子采摘于湖南永州，鼓風(fēng)干燥箱干燥，粉碎，密封，室溫保存。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(JS90103)購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 車前子總黃酮含量的測(cè)定[12-13]

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備

取車前子粉末(過40目篩)約1.0 g，精密稱定，加30 mL 70%乙醇回流提取60 min，取出，放冷，濾過，濾液用70%乙醇定容于50 mL量瓶中，搖勻，即得。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置10 mL刻度試管中，分別加70%乙醇至5.0 mL，加 一定量的5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min，加適量10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min，加適量4%氫氧化鈉溶液，再加70%乙醇至刻度，搖勻，靜置一定時(shí)間，即得。同法制成陰性對(duì)照溶液。照紫外-可見分光光度法，測(cè)吸光度值，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.4 車前子總黃酮的提取

1.2.2 單因素試驗(yàn)

取車前子粗粉約1 g，精密稱定，在其他條件平行的情況下，分別對(duì)不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取次數(shù)(提取1、2、3次)進(jìn)行單因素考察，然后確定最佳提取條件。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于正交試驗(yàn)具有“均衡分散”的特點(diǎn)，為了進(jìn)一步探討車前子的提取工藝的最佳提取條件、選擇影響較為顯著提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)和乙醇濃度(D)為考察因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.4 車前子總黃酮含量測(cè)定

按照正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取工藝，比較不同采收時(shí)間的車前子中總黃酮提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)總黃酮測(cè)定方法，得歸方程為：y=5.1521x+0.0732。式中y為510 nm處吸光度值，x為稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)液的質(zhì)量濃度，溶液在0.008～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系(圖1)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對(duì)車前子黃酮提取率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)車前子黃酮提取率的影響

由圖2可知，乙醇濃度對(duì)車前子總黃酮提取率的影響較大，其變化的趨勢(shì)為先增長(zhǎng)后降低，在乙醇濃度50%時(shí)提取率達(dá)到最大值，考慮50%乙醇為最佳提取濃度。

2.2.2 料液比對(duì)車前子黃酮含量的影響

圖3 料液比對(duì)車前子黃酮提取率的影響

如圖3所示，車前子總黃酮的提取率隨著料液比的增加呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，在料液比為1∶25時(shí)提取率最大，達(dá)28.36 mg/g，最后確定最佳料液比為1∶25。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)車前子黃酮提取率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)車前子的總黃酮提取率影響較大，提取率介于13.63～30.38 mg/g之間，車前子總黃酮的提取率隨著回流時(shí)間的變化呈先升高后緩慢降低的的趨勢(shì)，其中在90 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值，為30.38 mg/g，90 min后開始下降，可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)車前子中的黃酮苷類成分開始出現(xiàn)分解，導(dǎo)致其總黃酮的含量開始下降。最終確定車前子總黃酮提取的最佳時(shí)間為90 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)車前子提取率的影響

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)車前子提取率的影響

圖5 提取次數(shù)對(duì)車前子黃酮提取率的影響

由圖5可知，提取次數(shù)對(duì)車前子總黃酮的提取率影響并不明顯，提取率介于30.32～31.51 mg/g之間，提取率整體呈遞增趨勢(shì)，但是提取2次和提取3次的區(qū)別并不大，為了節(jié)約時(shí)間和溶劑，綜合考慮，最終確定提取次數(shù)為2次。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交分析表

為了進(jìn)一步得到回流提取車前子總黃酮最佳提取率，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)、回流提取時(shí)間(C)以及提取次數(shù)(D)四個(gè)因素進(jìn)行一個(gè)四因素三水平的正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)方差分析表2。

表2 方差檢驗(yàn)結(jié)果

由表1正交分析表可知，車前子總黃酮的提取工藝為：A3B3C3D2，即乙醇濃度60%，料液比1∶30，提取時(shí)間120 min，提取次數(shù)2次。又由表2方差分析表可知，RA > RC > RD > RB，即各因素的主次為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比>提取次數(shù)。乙醇濃度對(duì)車前子總黃酮提取率的影響最大，為主要因素，在生產(chǎn)上應(yīng)該把乙醇濃度作為提取的關(guān)鍵因素考慮，料液比和提取時(shí)間是重要影響因素，而提取次數(shù)為次要因素。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了考察車前子最佳提取工藝(A3B3C3D2)的穩(wěn)定性，做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，取車前子約1 g，精密稱定，分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，第1次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是的提取率為35.42 mg/g，第2次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是提取提取率為35.61 mg/g，第3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是提取率為35.72 mg/g。3次試驗(yàn)的提取率都十分相近，平均值為35.58 mg/g，RSD值為0.43%，小于2%，符合要求。最終確定該實(shí)驗(yàn)的最佳提取條件為A3B3C3D2。

2.3.3 不同采收時(shí)間車前子總黃酮的提取率

取其余批次車前子藥材約1 g，精密稱定，平行3份，檢測(cè)，計(jì)算不同采收時(shí)間車前子中總黃酮的提取率，結(jié)果見表3。

表3 不同采收時(shí)間的車前子總黃酮提取率

由表3可知，永州江永縣6～10月份車前子總黃酮提取率介于35.54～36.75 mg/g之間，其中九月份的提取率最高，達(dá)36.75 mg/g。由此可見九月份為永州車前子最佳采收時(shí)間。

4 結(jié)論

乙醇回流提取法是一種比較經(jīng)典的黃酮提取方法，成本較低、實(shí)用，也能很好的適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)。本文先對(duì)車前子的總黃酮提取率進(jìn)行單因素考察，再進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選出最佳工藝，最后采用該工藝對(duì)不同采收時(shí)間的車前子總黃酮提取率進(jìn)行比較，其中九月份的車前子總黃酮提取率最高，達(dá)36.75 mg/g，確定九月份為車前子的最佳采收時(shí)期。通過本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)橛乐蒈嚽白涌傸S酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，也為永州車前子的采收時(shí)間提供一定的理論依據(jù)。