馬元 屈百鳴 車(chē)賢達(dá) 徐強(qiáng) 俞堅(jiān)武 張慶剛 王利宏 盛蘭

1.浙江省人民醫(yī)院 杭州 310014 2.杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院 3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院

各種原因（如急性心肌缺血）引起的心肌損傷可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)異常和功能障礙，甚至引發(fā)患者死亡，傳統(tǒng)的治療方式雖能改善癥狀，但不能挽救壞死心肌。干細(xì)胞具有增殖能力和多向分化潛力，能夠從根本上增加有功能的心肌細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而改善心功能，因此干細(xì)胞治療為缺血性心臟病的治療開(kāi)辟了新的途徑[1-6]。干細(xì)胞動(dòng)員劑能夠動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，提高外周血干細(xì)胞數(shù)量，推動(dòng)干細(xì)胞向受損心肌歸巢和橫向分化，被稱(chēng)為體內(nèi)自身移植。這一過(guò)程由骨髓動(dòng)員、歸巢、轉(zhuǎn)化三個(gè)階段組成，干細(xì)胞動(dòng)員劑主要干預(yù)第一階段。“心肌一號(hào)”是由黃芪、麥冬、茯苓、佩蘭、防風(fēng)、大棗共6味中藥組成的經(jīng)驗(yàn)復(fù)方，課題組前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)其具有與干細(xì)胞動(dòng)員劑粒細(xì)胞集落刺激因子相似的作用[7]，但對(duì)干細(xì)胞歸巢的影響尚不明確。本研究擬探討心肌損傷后“心肌一號(hào)”在干細(xì)胞體內(nèi)自身移植第二階段中的作用機(jī)制，即對(duì)炎癥反應(yīng)的干預(yù)，力求使“心肌一號(hào)”更好地應(yīng)用于心肌損傷后的治療，彌補(bǔ)粒細(xì)胞集落刺激因子在干細(xì)胞體內(nèi)自身移植第二、三階段中可能存在的不足。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量200～250g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002]，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)研究由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心協(xié)同完成。

1.2 藥品及試劑 異丙基腎上腺素購(gòu)于上海禾豐制藥有限公司（批號(hào)：41160301）；中藥“心肌一號(hào)”由浙江省人民醫(yī)院中藥房提供；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其配體CX-C基序趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4） 酶聯(lián) 免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于ELISA Genie公司（批號(hào)：RTFI01117、RTFI01297）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：EK0526、EK0412、EK0406、EK0418）；SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：BA1389、PA1237、BA0131、A00021-2）。

1.3 急性心肌缺血模型的建立和分組 30只SD大鼠分別腹腔注射異丙基腎上腺素（5mg/kg），48h后隨機(jī)分為治療組、對(duì)照組、模型組3組，每組10只。模型組即刻處死后觀察心肌組織，心內(nèi)膜見(jiàn)彌散的白色點(diǎn)狀缺血灶表示造模成功[8]。

1.4 藥物處理 模型建立后，治療組每天同一時(shí)間給予“心肌一號(hào)”14g/kg（生藥量）灌胃，連續(xù)灌胃28d；對(duì)照組每天同一時(shí)間以等量0．9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 外周血炎癥及趨化因子測(cè)定 灌胃第7天和第28天采集兩組大鼠尾靜脈血，離心取上層血清，采用ELISA 法檢測(cè) SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

1.6 心肌組織學(xué)觀察 第28天尾靜脈取血后，以戊巴比妥麻醉，15%氯化鉀溶液靜脈注射處死大鼠，使大鼠心臟處于舒張期停搏狀態(tài)。2%多聚甲醛灌注后分離心臟，固定、脫水、包埋劑包埋后制成冷凍切片。HE染色后，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)單個(gè)視野中毛細(xì)血管數(shù)，每張切片選5個(gè)視野取平均值。Masson染色后，400倍顯微鏡下采用Image Pro Plus 6．0軟件定量分析單個(gè)視野纖維化面積，每張切片選5個(gè)視野取平均值。

1.7 免疫組化分析 標(biāo)本取材處理同1．6，免疫組化染色后，100倍顯微鏡下采用Image Pro Plus 6．0軟件定量分析單個(gè)視野染色程度，以灰度值表示SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10 和膠原的表達(dá)水平，每張切片選3個(gè)視野取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 14．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠外周血炎癥及趨化因子水平比較 至灌胃28d結(jié)束，對(duì)照組大鼠死亡1只。第7天和第28天兩組大鼠 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10 水平部分太低無(wú)法測(cè)出，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；第7天兩組大鼠SDF-1、CXCR4 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），第 28天治療組SDF-1水平低于對(duì)照組、CXCR4水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，P＜0．01）。見(jiàn)表 1。

表1 兩組大鼠外周血趨化因子水平比較（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

表1 兩組大鼠外周血趨化因子水平比較（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01Note：Compared with control group,*P＜0．05,**P＜0．01

第28天SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1） SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1）治療組對(duì)照組組別 第7天images/BZ_67_1433_2810_1462_2858.png145．278±31．528 162．590±14．958 1．737±0．498 1．705±0．367 195．506±24．686*225．274±30．030 1．562±0．259**0．511±0．058

2.2 兩組大鼠心肌毛細(xì)血管密度和纖維化面積比較第 28 天治療組大鼠心肌毛細(xì)血管密度（2．76±2．471）條，與對(duì)照組（2．62±2．543）條比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；治療組大鼠心肌纖維化面積（1．64±1．590）×104像素小于對(duì)照組（5．12±4．963）×104像素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)圖 1、2。

圖1 第28天兩組大鼠心肌毛細(xì)血管密度比較（HE染色，200×）Fig．1 Comparison of myocardial capillary density in each group on the 28th day(HE stain,200×)

圖2 第28天兩組大鼠心肌纖維化面積比較（Masson染色，400×）Fig．2 Comparison of myocardial fibrosis area in each group on the 28th day(Masson stain,400×)

2.3 兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子水平比較 第28天治療組大鼠心肌SDF-1、CXCR4、IL-10水平高于對(duì)照組，而心肌TNF-α水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見(jiàn)表 2、圖 3。

3 討論

表2 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子免疫組化陽(yáng)性面積比較（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

表2 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子免疫組化陽(yáng)性面積比較（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

注：與對(duì)照組比較，**P＜0．01Note：Compared with control group,**P＜0．01

組別 TNF-α（×103） IL-10（×104） SDF-1（×105） CXCR4（×104）治療組對(duì)照組2．00±1．905**28．87±21．505 29．83±15．442**1．89±1．867 20．07±8．479**4．87±0．324 3．61±1．341**1．49±0．877

所有組織損傷（包括心肌損傷）后，損傷部位釋放炎癥因子和趨化因子[9]，這些因子對(duì)于干細(xì)胞歸巢至關(guān)重要。炎癥因子包括促炎因子，如TNF-α、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等；抗炎因子，如 IL-4、IL-10等，對(duì)炎癥反應(yīng)起調(diào)控作用。趨化因子誘導(dǎo)干細(xì)胞從外周血向受損心肌遷移，主要通過(guò)SDF-1及其配體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮作用[10]。有些細(xì)胞因子同時(shí)具備炎癥因子和趨化因子的作用，如TNF-α[11]。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)有利于清除壞死細(xì)胞，形成新生血管，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)在加速心臟重構(gòu)的同時(shí)，還會(huì)影響干細(xì)胞在受損心肌的定植，而心肌損傷常伴隨免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活[12-13]，導(dǎo)致過(guò)度的炎癥反應(yīng)。與此同時(shí)，抗炎治療往往又容易抑制正常的炎癥反應(yīng)，同時(shí)削弱趨化作用。因此，對(duì)干細(xì)胞歸巢的干預(yù)，亦即對(duì)炎癥因子和趨化因子的干預(yù)。

圖3 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子水平比較（100×）Fig．3 Comparison of level of myocardial inflammatory factors and chemotactic factors in each group on the 28th day(100×)

“心肌一號(hào)”是由黃芪、麥冬、茯苓、佩蘭、防風(fēng)、大棗共6味中藥組成的經(jīng)驗(yàn)復(fù)方，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水滲濕、補(bǔ)中益氣、活血化瘀等功效。在筆者所在科室，該藥物已經(jīng)被用于擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭的臨床治療，并已被臨床證實(shí)能夠延緩心臟擴(kuò)大，提高左室射血分?jǐn)?shù)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪等中藥具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，機(jī)制包括減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、調(diào)控炎癥相關(guān)細(xì)胞因子、減少黏附分子表達(dá)、抑制核轉(zhuǎn)錄因子活性等[14-16]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，“心肌一號(hào)”具有正向調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸的作用[17]，而且能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生成和釋放，其作用與粒細(xì)胞集落刺激因子類(lèi)似[7]。因此本研究進(jìn)一步考察“心肌一號(hào)”調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，探究“心肌一號(hào)”調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的同時(shí)對(duì)趨化作用有何影響，以及以上作用在干細(xì)胞歸巢、心肌修復(fù)過(guò)程中的具體體現(xiàn)。

一般認(rèn)為，心肌損傷后炎癥反應(yīng)在7d內(nèi)達(dá)到最強(qiáng)；前期研究則提示，以用藥第28天作為評(píng)估“心肌一號(hào)”療效的時(shí)間點(diǎn)是合適的。通過(guò)對(duì)兩組大鼠第7天和第28天的外周血檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，炎癥因子水平部分太低無(wú)法測(cè)出，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，但觀察原始數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，“心肌一號(hào)”對(duì)心肌損傷后外周血炎癥因子的實(shí)際影響并不大（至少不存在成倍增減的情況）。第28天治療組外周血趨化因子SDF-1水平顯著低于對(duì)照組、CXCR4顯著高于對(duì)照組，故SDF-1/CXCR4總體變化可能并不大，而心肌免疫組化染色以及圖像分析提示治療組趨化因子SDF-1、CXCR4水平均顯著高于對(duì)照組，這與Li等[18]研究顯示的趨化因子在受損組織局部-外周血中應(yīng)成梯度關(guān)系一致。免疫組化染色以及圖像分析還提示，第28天治療組促炎癥因子TNF-α水平顯著低于對(duì)照組，而抗炎癥因子IL-10顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明在受損心肌局部，促炎癥因子受到抑制而抗炎癥因子釋放增多。組織學(xué)觀察提示兩組大鼠毛細(xì)血管密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而治療組心肌纖維化面積較對(duì)照組顯著減少，與預(yù)期大致相符。

綜上所述，“心肌一號(hào)”在損傷心肌局部有效抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)明顯升高趨化因子濃度，作用強(qiáng)于外周血中，可能的機(jī)制是心肌細(xì)胞對(duì)“心肌一號(hào)”具有高度敏感性，當(dāng)然也不能排除外周血容量大、細(xì)胞因子濃度低及檢測(cè)方法等因素對(duì)結(jié)果造成的干擾。對(duì)于急性心肌損傷高炎癥反應(yīng)狀態(tài)而言，“心肌一號(hào)”抑制促炎癥效應(yīng)、促進(jìn)抗炎癥效應(yīng)，使心肌纖維化范圍相對(duì)縮小，但促進(jìn)干細(xì)胞在受損心肌定植的趨化作用反而增強(qiáng)，且并不影響心肌新生血管的形成，總體療效較理想?！靶募∫惶?hào)”減弱炎癥反應(yīng)，但總體結(jié)果與炎癥反應(yīng)減弱-趨化作用下降、炎癥反應(yīng)減弱-新生血管形成減少的常規(guī)關(guān)系[12,19]不相符，這可能需要用“心肌一號(hào)”獨(dú)立于炎癥反應(yīng)外的其他作用機(jī)制來(lái)解釋?！靶募∫惶?hào)”最終使急性心肌損傷的炎癥反應(yīng)調(diào)控于一個(gè)合理水平，體現(xiàn)了中藥復(fù)方不同藥效物質(zhì)群由“調(diào)”至“平”的系統(tǒng)效應(yīng)。當(dāng)然，本研究存在選取的炎癥因子及趨化因子種類(lèi)偏少、觀察時(shí)間點(diǎn)偏少等不足之處，有待今后進(jìn)一步研究深入探討。