王衛(wèi)強, 羅 超, 張海娟， 杜勝男， 李 佳

(遼寧石油化工大學 石油天然氣工程學院，遼寧 撫順113001)

石蠟是一種含有正構(gòu)烷烴、異構(gòu)烷烴和環(huán)烷烴的復(fù)雜混合物[1]。當含蠟原油在開采與運輸過程中的溫度降至析蠟點時，油流中的蠟組分結(jié)晶析出、沉積在輸油管壁上，致使管道有效流通面積減小，管道輸送能力下降[2]。此外，長期在低溫環(huán)境下輸送含蠟原油會帶來管道堵塞的安全隱患[3-5]。微生物清防蠟方法可降低原油蠟含量，減少蠟沉積，提高原油流動性[5]，具有高效環(huán)保[6]、作用周期長、成本低等特點[7]，已成為研究熱點。尤其隨著三次采油技術(shù)的迅速發(fā)展，依靠傳統(tǒng)方法來解決含蠟原油在開采和運輸過程中面臨的難度和生產(chǎn)成本問題已越來越不能滿足要求[8]，從而，促進了微生物清、防蠟技術(shù)在含蠟原油開采和運輸中的應(yīng)用。

針對大慶含蠟原油特點，筆者從石油污染的土壤中分離出一株嗜蠟菌，考察了其除蠟降黏效果,測定了其代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑種類的性能。

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

含蠟原油樣品來自于大慶油田，蠟質(zhì)量分數(shù)為14.6%，密度為872 kg/m3，在37 ℃條件下表觀黏度為2614 mPa·s。液體石蠟，分析純，天津市致遠化學試劑有限公司產(chǎn)品。煤油，分析純，天津市盛鑫源偉業(yè)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

土壤樣品為大慶含蠟原油污染土壤。

實驗所用培養(yǎng)基有：

Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，分析純，250 g)：去離子水1000 mL、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、pH值7.0±0.2。添加15%瓊脂，得到LB固體培養(yǎng)基。

無機鹽培養(yǎng)基(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，分析純，500 g)：去離子水1000 mL、K2HPO41 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NH4Cl 1 g、 NaNO31 g、微量元素液10 mL。

微量元素液(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品，分析純，100 g)：去離子水1000 mL、MnSO40.01 g、FeSO40.1 g、CaCl·2H2O 0.01 g、ZnSO40.01 g、CuSO4·5H2O 0.01 g、CoCl 0.01 g、H3BO40.01 g、NaMoO40.01 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜蠟菌的篩選及鑒定

將5 g石油污染土壤加入100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，并添加0.5 mL液體石蠟，在37 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)3 d，然后取1 mL上清液加入新鮮培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁時，再次轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接過程中液體石蠟添加量由0.5 mL逐步提升到 5 mL。如此反復(fù)轉(zhuǎn)接6次后，將100 μL上清液梯度稀釋后涂布于LB固體平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出菌落后，挑出單菌落反復(fù)劃線純化，分離出嗜蠟菌。將菌株交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16SrDNA測序，測序結(jié)果在NCBI中進行比對，確定該菌菌屬。

1.2.2 菌株最適生長環(huán)境的優(yōu)化

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至108CFU/mL，以3%接種量接種于100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，并添加2%石蠟為碳源，在不同溫度、pH值、鹽含量條件下通過紫外分光光度計(上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品)測定菌株生長曲線。

最適生長溫度測定：在31、34、37、40、43 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，通過紫外分光光度計(波長為600 nm)測定菌液光密度值(OD)。

最適生長pH值測定：用HCl與NaOH將無機鹽培養(yǎng)基pH值調(diào)為5～9，并測定OD值。

最適生長NaCl含量測定：將無機鹽培養(yǎng)基NaCl質(zhì)量分數(shù)調(diào)節(jié)為0～5%，并測定OD值。

1.2.3 代謝產(chǎn)物——生物表面活性劑的分析

將菌株以3%接種量接種于100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，并添加2%石蠟為碳源，增設(shè)不加菌無機鹽培養(yǎng)基為對照，在37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。

界面張力測定：將發(fā)酵液(即加入菌株培養(yǎng)一定時間后的培養(yǎng)基)離心去除菌體，采用JJ2000B旋轉(zhuǎn)滴界面張力測量儀(上海中晨數(shù)字設(shè)備有限公司產(chǎn)品)測定發(fā)酵液界面張力，并與不加菌的對照組比較。

發(fā)酵液乳化性能測定：將實驗組發(fā)酵液與對照組中的無機鹽培養(yǎng)基各取4 mL分別與4 mL液體石蠟混合，采用渦旋混合器高速振蕩2 min，在室溫下靜置24 h后，測量乳化高度，并根據(jù)公式(1)計算乳化系數(shù)(E24)[9-10]。

(1)

式(1)中：h為乳化層高度，cm；H為混合液體總高度，cm。

排油圈測定：量取60 mL去離子水加入直徑為 15 cm 的潔凈無菌平皿中，并在平皿中心添加1 mL經(jīng)油紅染色的液體石蠟形成油膜，向油膜中心滴 50 μL 經(jīng)離心去除菌體的發(fā)酵液，觀察排油圈的形成情況。

表面活性劑提取及鑒定：將菌株發(fā)酵液離心去除菌體，用6 moL的HCl將上清液pH值調(diào)為2，4 ℃ 條件下靜置12 h，再離心收集沉淀，然后溶于氯仿與甲醇混合液(氯仿/甲醇體積比為2/1)中，過濾后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃條件下蒸干有機相，得到生物表面活性劑。將1 mg生物表面活性劑與100 mg KBr混合研磨、壓片，通過傅里葉紅外光譜儀(美國熱電公司產(chǎn)品)在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)檢測。

1.2.4 細胞疏水性測定

通過高速離心機(日本HITACHI產(chǎn)品)在10000 r/min條件下將發(fā)酵液離心收集菌體，用緩沖液洗滌2次，并用緩沖液將菌體的光密度值(OD1)稀釋至0.3～0.6；再將等體積煤油與菌液混合，高速渦旋振蕩2 min，靜置1 h，同等條件下測定水相(菌液)的OD2，細胞疏水性通過公式(2)進行計算[11]。

細胞疏水性=(1-OD2/OD1)×100%

(2)

1.2.5 菌株降解性能測定

將菌株以3%接菌量接入100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，加入50 mL大慶含蠟原油，在37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后，通過差示掃描量熱儀(美國TA梅特勒-利托多公司產(chǎn)品)測定含蠟原油蠟含量、析蠟點、析蠟高峰點等參數(shù)變化[12]。收集對照組與實驗組的含蠟原油，通過高速冷凍離心機在轉(zhuǎn)速為3000 r/min條件下低速離心脫水后，測量菌株處理前后原油的質(zhì)量變化。

1.2.6 菌株對蠟晶結(jié)構(gòu)形態(tài)影響的測定

取少量低速離心脫水后的油樣均勻置于載玻片上，在37 ℃、100倍放大倍數(shù)條件下，通過BX-53偏光顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品)觀察嗜蠟菌處理后蠟晶的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.7 菌株對原油流變性影響的測定

將50 mL含蠟原油與100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，以3%接種量將嗜蠟菌接入，并設(shè)置不加菌對照組，在37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)7 d后離心脫水，在不同溫度及剪切率條件下通過HAAKE流變儀(上海珩璟科技有限公司產(chǎn)品)對油樣黏度進行測量，并繪制黏-溫曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 嗜蠟菌的鑒定結(jié)果

16SrDNA測序結(jié)果在NCBI中比對后，結(jié)果表明：嗜蠟菌樣品與假單孢菌屬同源性達到99%以上，因此可確定該嗜蠟菌為假單孢菌屬。

2.2 菌株最適生長環(huán)境的優(yōu)化選擇

不同的環(huán)境因素可促進或抑制微生物的生長，而微生物清防蠟技術(shù)的關(guān)鍵就是確保微生物具有良好的活性強度，最大程度發(fā)揮菌種性能。通過測定菌液OD值的大小可以反映出菌株活性強度，OD值越大菌株活性越強，從而優(yōu)化出菌株最適生長環(huán)境。每12 h通過紫外分光光度計測定菌液在不同條件下的OD值，并據(jù)此繪制菌株生長曲線，見圖1。

從圖1可以看出：菌株活性強度隨溫度的變化呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢；當溫度較低時，菌體內(nèi)蛋白活性低，活性強度較弱；而在較高溫度下，菌體內(nèi)活性蛋白功能減弱，菌株生長遭到抑制。為充分發(fā)揮菌種性能，確定菌株最適生長溫度為37 ℃。

圖1 不同溫度下菌株的生長曲線Fig.1 Growth curves of strains at different temperatures

圖2為不同pH值條件下菌株的生長曲線。從圖2可以看出：菌株在pH值為5～9范圍內(nèi)都具有較高活性強度；當培養(yǎng)基pH值為7時，活性強度最高。這表明該菌株最適合在中性環(huán)境下生長，并對弱酸或弱堿環(huán)境都具有一定適應(yīng)能力。而為保證菌株較高降解作用，確定菌株最適pH值為7.0。

圖2 不同pH值條件下菌株的生長曲線Fig.2 Growth curves of strains with different pH values

不同鹽含量會影響細胞滲透壓，過高或過低的滲透壓均會抑制細菌生長[13]。圖3為不同NaCl含量下菌株的生長曲線。從圖3可以看出,菌株活性強度隨著NaCl含量增加呈現(xiàn)出先增強后減弱趨勢，并在NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%時活性最強。因此，確定菌株最適NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%。

圖3 不同鹽含量下菌株的生長曲線Fig.3 Growth curves of strains with different salt contentsw(Salt)/%: 0; 1; 2; 3; 4; 5

2.3 代謝產(chǎn)物——生物表面活性劑的分析結(jié)果

2.3.1 界面張力測定結(jié)果

通過界面張力測量儀測得不加菌對照組溶液的界面張力為78.26 mN/m，而測得加菌發(fā)酵液(去除菌體)的界面張力為37.45 mN/m，說明該菌株顯著降低了液體界面張力，可促進油、水兩相混合，有利于菌株對石蠟的降解。

2.3.2 乳化性能結(jié)果

生物表面活性劑的乳化性能是微生物清、防蠟的一個重要指標[14]。乳化作用可形成水包油乳狀液，可降低摩擦阻力，還可增大細菌與石蠟的接觸面積[15]，促進細菌降解。混合液靜置24 h后，發(fā)現(xiàn)不加菌對照組無乳化現(xiàn)象產(chǎn)生，而菌株發(fā)酵液乳化現(xiàn)象顯著，通過測量乳化層高度，并通過公式(1)計算得到菌株乳化系數(shù)約為70%。結(jié)果表明，該嗜蠟菌具有較強的乳化性能，有利于提高含蠟原油的流動性。

2.3.3 排油圈測定結(jié)果

將培養(yǎng)7 d后的發(fā)酵液離心去除菌體后進行排油活性測定，發(fā)現(xiàn)油膜由中心向四周排擠，形成了一個直徑約為9.1 cm的排油圈，如圖4所示。這表明該嗜蠟菌能產(chǎn)生較高含量的生物表面活性劑。排油圈直徑的大小與生物表面活性劑的活性成正比，嗜蠟菌產(chǎn)生的生物表面活性劑，在增加蠟溶解度方面具有較好促進作用，有利于細菌降解。

2.3.4 生物表面活性劑的提取及鑒定結(jié)果

實驗菌株代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑的光譜圖如圖5所示。

從圖5可以看出：生物表面活性劑在3281.71 cm-1處出現(xiàn)了1個特征峰，是由分子間氫鍵引起的—NH鍵伸縮振動；2920.45 cm-1和2852.12 cm-1處的特征峰是脂肪族的—CH鍵伸縮振動；1668.42 cm-1和1542.54 cm-1處的吸收峰表明存在1個仲酰胺鍵(—CO—N)；1454.76 cm-1的吸收峰表明此處有CH3基團做不對稱形變振動；1062.09 cm-1的吸收峰為C—O—C對稱伸縮振動。該生物表面活性劑在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰與脂肽的吸收峰相一致，因此確定為脂肽類物質(zhì)。結(jié)果表明，該嗜蠟菌在降解石蠟過程中可產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，與Liu、Cheng、Ismail等[16-18]的實驗結(jié)果相一致。

圖4 發(fā)酵液排油活性檢測照片F(xiàn)ig.4 Test photos of oil displacement activity offermentation broth(a) Oil film morphology of fermentation broth was added to the control group; (b) Oil film morphology of fermentation broth with drop addition

圖5 菌株代謝產(chǎn)物生物表面活性劑的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopyof strain metabolites

2.4 細胞疏水性分析結(jié)果

實驗測得經(jīng)緩沖液稀釋菌液的光密度值OD1為0.507；將等體積的煤油與菌液混合后，測得菌液的光密度值OD2為0.397；通過公式(2)計算出細菌的細胞疏水性為21.69%。細胞疏水性與烴類物質(zhì)的降解有著密切聯(lián)系，疏水性高的細菌更易附著在疏水性底物上，加快對該物質(zhì)的降解[19]。結(jié)果表明，該菌株具有較強疏水性能，為石蠟降解提供了有利條件。此結(jié)果與王靖等[20]的實驗結(jié)果相一致。

2.5 菌株降解性能分析結(jié)果

菌株處理前后含蠟原油的蠟含量、析蠟點、析蠟高峰點測定結(jié)果如表1所示。

表1 菌株處理前后含蠟原油蠟含量、析蠟點及析蠟高峰點的變化Table 1 Changes of wax content, wax precipitation point andwax peak point of waxy crude oil before andafter strain treatment

從表1分析得到，含蠟原油在經(jīng)菌株作用后，其蠟含量、析蠟點、析蠟高峰點及油質(zhì)量均降低，除蠟率達到43%，析蠟點降低1.27 ℃，析蠟高峰點降低1.19 ℃，原油質(zhì)量降低3.02 g。石蠟為C16～C28之間的飽和烴。實驗結(jié)果說明菌株對該區(qū)間的烴類物質(zhì)的降解較為顯著。蠟含量的降低，可大幅減少蠟沉積；而析蠟點及析蠟高峰點的降低在一定程度上還有利于減少蠟組分的析出，具有一定清、防蠟作用。

2.6 菌株對蠟晶結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

菌株處理前后含蠟原油樣品中的蠟晶結(jié)構(gòu)如圖6 所示。從圖6(a)可以看出：加菌處理前含蠟原油中的蠟晶尺寸大、成塊狀聚集、分布密集。含蠟原油經(jīng)過嗜蠟菌處理后，油中蠟晶數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)尺寸減小且分布更為稀疏，從而使蠟晶間不易形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)，一定程度上可減少蠟沉積的形成。

圖6 菌株處理前后含蠟原油中的蠟晶結(jié)構(gòu)Fig.6 Structure of wax crystal in crude oilbefore and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

2.7 菌株對原油流變性的影響

不同溫度及不同剪切率條件下測得菌株處理前后含蠟原油樣品的黏-溫曲線如圖7所示?？梢钥闯?，含蠟原油經(jīng)嗜蠟菌處理后，含蠟原油非牛頓流體黏度從488.4～5259 mPa·s下降到400.5～4294 mPa·s，黏度約下降18%，反常點由46 ℃降至44.5 ℃。黏度與反常點是判定原油流動性好與差的重要指標，二者數(shù)值越低越利于提高原油流動性能。該菌株通過降解石蠟，降低了含蠟原油的黏度及反常點，從而有效提高了含蠟原油流動性。

圖7 菌株處理前后含蠟原油的黏-溫曲線Fig.7 Viscosity-temperature curves of waxy crude oil before and after strain treatment(a) Before strain treatment; (b) After strain treatment

3 結(jié) 論

(1)嗜蠟菌經(jīng)16SrDNA鑒定為假單孢菌屬。該菌株最適生長環(huán)境為溫度37 ℃、pH值7.0、NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%。

(2)該嗜蠟菌具有較強的表面活性，能產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，可將發(fā)酵液界面張力由78.26 mN/m降低至37.45 N/m，乳化系數(shù)達到70%，并具有較強的排油活性及良好的疏水性能。

(3)含蠟原油經(jīng)嗜蠟菌處理7 d后，油樣中蠟晶結(jié)構(gòu)尺寸減小及數(shù)量減少，可使含蠟原油析蠟點降低1.27 ℃、析蠟高峰點下降1.19 ℃、蠟含量降低43%、黏度降低18%，有效提高了含蠟原油流動性。