孫豐盛，孫浩偉，郭霧晴

摘 要：在梳理各國科學家研究細胞核移植技術體系的基礎上，重點介紹了家畜細胞核移植技術的起源、發(fā)展歷程、存在困難及發(fā)展前景。

關鍵詞：細胞核移植;研究;進展

文章編號：1004-7026（2019）16-0102-02 ? ? ? ? 中國圖書分類號：Q813? ? ? ?文獻標志碼：A

細胞核移植技術是將從供體細胞中提取的細胞核移至除去核的卵母細胞，再將此細胞移植到受體動物體內(nèi)，使其在受體動物內(nèi)妊娠并分娩的技術。雖然在技術上仍然存在各種困難，但這并不妨礙其擁有廣闊的應用前景。

1 ?細胞核移植技術研究歷史

德國生物學家Spemann利用蠑螈進行了初次細胞核移植試驗并在之后認為可以克隆高等動物。1952年，Briggs和King成功克隆出了蝌蚪。1958年，英國科學家JohnGurdon第一次利用體細胞核移技術創(chuàng)造出非洲爪蟾，并因此獲得2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。直至1963年，J.B.SHaldane才創(chuàng)造了“克隆”（clone）一詞。1986年，丹麥科學家克隆出的綿羊是首次經(jīng)證實通過細胞核移植技術產(chǎn)生的哺乳動物。此時學者普遍相信，成年動物的體細胞無法進行體細胞核移植。但是，1997年“多莉（Dolly）”[1]的誕生打破了這一觀點;同年，一只恒河猴[2]也通過克隆技術產(chǎn)生。自Dolly誕生以來，已有20多種哺乳動物被克隆成功[3]。中國科學家分別于2007年和2018年在中國本土成功克隆出水牛[4]和獼猴[5]。

2 ?亟待解決的問題

雖然通過細胞核移植技術克隆出許多動物，但是克隆動物存在各種問題，例如胚體外培養(yǎng)發(fā)育率低，受體家畜出現(xiàn)的流產(chǎn)率、畸胎率升高和后代個體早衰、早亡等。如“多莉”羊患有關節(jié)炎，而且染色體的端粒酶變短。相關機理還需要根據(jù)分子遺傳學、組織胚胎學及細胞工程、蛋白質(zhì)工程進行研究。

2.1 ?供體種類來源及所處時期

進行細胞核移植，首先要選擇合適的供體細胞種類。不同動物有不同的適宜細胞，如牛有成體成纖維細胞、顆粒細胞、卵丘細胞、輸卵管上皮細胞、乳腺上皮細胞等多種供體細胞。Kubota等通過研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細胞是最佳的供體類型。通常情況下，供體卵細胞來自體外培養(yǎng)的卵母細胞，不同動物的卵母細胞利用情況也不同，例如犬的卵母細胞十分敏感，不易培養(yǎng)，總體的成熟率不足20%[6]。

使細胞同期化的處理方法有接觸抑制法、血清饑餓法和化學處理法。但是3種不同的處理方法對胚胎發(fā)育的影響還不明確。Wilmut等使用血清饑餓法，使供體細胞處于G0期，以便于后期工作，此后大部分學者在克隆過程中效仿此法。Gibelli等用活躍分裂的胎兒成纖維細胞（56%為G1期）為供體，克隆出4頭牛犢，證明了非G0期細胞也可作為核供體。Boquest等（1990）[7]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細胞血清饑餓5 d后，大量細胞出現(xiàn)凋亡的特征。

2.2 ?構建、融合、激活重組胚

構建融合激活重組胚常用的方法可分為3類，即生物融合法（用仙臺病毒等病毒誘導融合）、化學融合法（用聚乙二醇等化學物質(zhì)誘導融合）和物理融合法（用離心、震動、電刺激因素刺激誘導融合）。動物體細胞核移植中最常用的是電融合法，但是針對不同的生物，不同的試驗方法具體參數(shù)還需分類討論。

此外，進行細胞核移植成本極高，獲得卵母細胞，構建重組胚，進行胚胎體外培養(yǎng)等所需的儀器、設備、藥品試劑價格極為昂貴。例如“多莉”羊的花費就已經(jīng)超過200萬英鎊。

3 ?應用及前景

3.1 ?作為生物反應器

轉(zhuǎn)基因技術和生物克隆技術快速發(fā)展，可以將人們所需的基因?qū)氲絼游矬w內(nèi)，使動物發(fā)展成為“活體生物反應器”，產(chǎn)生人們所需要的藥物蛋白。例如，DNX公司把人的血紅蛋白基因轉(zhuǎn)入豬的細胞，可以制造生產(chǎn)人血紅蛋白。

3.2 ?器官生產(chǎn)

利用克隆技術可以生產(chǎn)人體所需的內(nèi)臟器官，用于器官移植或替換體內(nèi)衰老或發(fā)生病變的器官。很早就有醫(yī)生使用豬的心臟瓣膜、凝結因子、胰島細胞等治療人類疾病，但是存在嚴重的排斥反應。最新研究通過競爭、抑制和剔除α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，來阻止超急性排斥反應[8]，以實現(xiàn)豬器官異種移植治療人類疾病。利用此法可緩解器官捐獻數(shù)量不足的問題，挽救人類生命。

3.3 ?提高品種質(zhì)量

眾所周知，豬、雞等規(guī)模化養(yǎng)殖的家畜個體利潤極低，只有大規(guī)模養(yǎng)殖才能獲得可觀的經(jīng)濟效益，這很大程度上取決于家畜的繁殖能力，為此育種學者們采取了世代篩選、人工授精等措施來提高家畜的繁殖能力。隨著克隆技術的發(fā)展，為了獲得高產(chǎn)仔數(shù)的母牛，可以將具有高產(chǎn)仔數(shù)的母牛進行體外胚胎培養(yǎng)后移植到低產(chǎn)仔數(shù)的母牛體內(nèi)，即可獲得優(yōu)良的品系，利用此法不僅可以保護優(yōu)良品系，更可以提高畜牧業(yè)的繁殖效率。利用重復克隆技術能使同一優(yōu)良品種無限繁殖下去，在擴大種群數(shù)量方面有極大的優(yōu)勢。

3.4 ?保護瀕危物種

很多瀕危野生動物即使通過人工繁殖，也無法維持現(xiàn)有種群的數(shù)量。對此，可以將瀕危物種的細胞核移植到血緣相近的非瀕危動物卵細胞，進行體外胚胎培養(yǎng)，再移入非瀕危動物體中妊娠產(chǎn)仔，從而提高種群的數(shù)量[9]。此法屬于異種克隆，不僅成本高，而且實現(xiàn)難度大，如果能夠成功，在保護瀕危動物方面將有極大的幫助。

參考文獻：

[1]Wilmut I，Schnieke AE，J Mcwhir，et al.Viable offspringderived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature，1997，385（6619）：810-813.

[2]MENG L，ELY J J，STOUFFER R L，et al.Rhesus monkeys produced bynuclear transfer[J].Biology of Reproduction，1997，57（2）：454-459.

[3]Thuan NV，Kishigamis，wakayamat.Howe to improve the success rate of mouse cloning technology[J].Jre-prodDev，2010，56（1） ：20-30.

[4]SHI D，LU F，WEI Y，et al.Buffalos（Bubalusbubalis） cloned by nuclear transfer of somatic cells[J].Biol Reprod，2007，77（2）：285-291.

[5]LIU Z，CAI Y，WANG Y，et al.Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer[J].Cell，2018，172（4）：881-887.

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[7]Boquest AC，Day BN，Prather RS.Flowcy tometriccell analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells[J].BiolReprod，1999，60（40）：1013.

[8]尹海芳，李寧.豬作為異種器官移植供體的研究進展[J].生物技術通訊，2011，12（4）：329-331.

[9]李光華，葉紹輝.動物體細胞克隆技術的研究進展[J].家畜生態(tài)學報，2006（4）：1-5.