石衛(wèi)紅 李小林 巫國輝

[摘要]目的：為了探討不同水平的瘦素受體（OB-RGRP）調(diào)節(jié)大鼠脂肪細(xì)胞的研究及其作用機(jī)制，明確其對脂肪細(xì)胞的影響，為瘦素受體治療肥胖癥提供理論依據(jù)。方法：原代分離大鼠脂肪細(xì)胞，利用油紅O染色進(jìn)行鑒定，構(gòu)建過表達(dá)OB-RGRP和干擾OB-RGRP載體，利用Western blot驗證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果，并檢測JAK2、STAT3及其磷酸化的表達(dá)情況。結(jié)果：細(xì)胞分離正確，構(gòu)建的OB-RGRP-siRNA轉(zhuǎn)染有效，與對照組相比，過表達(dá)OB-RGRP組的p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯升高，干擾OB-RGRP組的p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而JAK2、STAT3總蛋白各組之間無差異。結(jié)論：OB-RGRP水平通過JAK2/STAT3信號通路在調(diào)節(jié)瘦素抵抗中起著重要作用，調(diào)節(jié)脂肪代謝，有助于改善瘦素抵抗及肥胖防治。

[關(guān)鍵詞]OB-RGRP;瘦素受體;Western blot;JAK2/STAT3信號通路;脂肪細(xì)胞;肥胖癥

[中圖分類號]R329.2+8 ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）11-0090-03

Abstract： Objective ?To investigate the mechanism of leptin receptors（OB-RGRP） in regulating obesity In order to investigate the regulation of different levels of leptin receptor ?on adipocytes in rats and its mechanism of action， and to clarify its effect on adipocytes， so as to provide theoretical basis for the treatment of obesity by leptin receptor. Methods ?Primary rat adipocytes were isolated and identified by oil red O staining. OB-RGRP overexpressed and OB-RGRP interfering vectors were constructed. The cell transfection effect was verified by Western blot， and the expression of JAK2， STAT3 and their phosphorylation were detected. Results ?The cells were isolated correctly and the constructed OB-RGRP-siRNA was effective in transfection. Compared with the control group， the overexpression of p-JAK2 and p-STAT3 in the OB-RGRP group was significantly increased， while the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in the OB-RGRP group was significantly decreased， and the difference was statistically significant （P <0.05）.There was no difference between JAK2 and STAT3 groups. Conclusion ?OB-RGRP level plays an important role in regulating leptin resistance through the JAK2/STAT3 signaling pathway， regulating fat metabolism and contributing to the improvement of leptin resistance and the prevention and treatment of obesity.

Key words： OB-RGRP; leptin receptor; Western blot; JAK2/STAT3 signal path; adipocyte; adiposis

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，肥胖問題越來越受到關(guān)注，發(fā)達(dá)國家肥胖率顯著高于發(fā)展中國家，而我國近年來的肥胖率也顯著升高[1-2]。據(jù)報道，我國成人肥胖率由1989年的1.32%迅速增長到2009年的9.62%[3]。肥胖是由多種因素決定的，過度飲食，超范圍的熱量攝取，運(yùn)動量不足以及一些疾病或遺傳等因素均可能導(dǎo)致肥胖。除去外在的飲食與運(yùn)動因素，肥胖還與基因的調(diào)控有關(guān)，瘦素（1eptin）是由肥胖基因（OB gene）編碼，脂肪組織分泌的激素具有抑制食欲、調(diào)節(jié)能量代謝，通過結(jié)合瘦素受體（1eptin receptor，OB-RGRP）發(fā)揮其調(diào)節(jié)脂肪蛋白質(zhì)等能量代謝的作用[4-5]。因此機(jī)體的瘦素水平或是瘦素受體的水平對肥胖起到關(guān)鍵作用。

本研究通過構(gòu)建瘦素受體（OB-RGRP）過表達(dá)載體和干擾載體，轉(zhuǎn)染至大鼠脂肪細(xì)胞，通過Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)，探索不同瘦素受體水平對大鼠脂肪細(xì)胞的影響及其可能的作用機(jī)制和調(diào)節(jié)方式。

1 ?材料和儀器

1.1 實驗動物：SD大鼠購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）（2016-0002）。SD大鼠飼養(yǎng)：采用無毒塑料鼠盒，不銹鋼絲籠蓋，金屬籠架。籠架可移動，并可經(jīng)受多種消毒方法滅菌。

1.2 實驗試劑與儀器：DMEM（1×）+GlutaMAXTM-1 Dulbeccos Modified Eagle Medium（gibco 1859228）;Lipofectamine? 3000（invitrogen 18882752）;OB-RGRP-si-RNA（通用生物BIO33001）;I型膠原酶（Solarbio C8150）;油紅染色試劑盒（KGA329，KeyGen）;EcoRI（ER0271，Thermo Scientific）;XhoI（ER0691，Thermo Scientific）;Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2 000）;辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金橋，1/2 000）;Rabbit Polyclonal Anti-OB-RGRP（別名：LEPR）（DF7139，Affinity，1/500）;Rabbit Monoclonal Anti-JAK2 （ab108596，abcam，1/5 000）;Rabbit Monoclonal Anti-JAK2 （phospho Y1007+Y1008）（ab32101，abcam，1/1 000）;Rabbit Monoclonal Anti-STAT3 （phospho S727） （ab32143，abcam，1/1 000）;Rabbit Polyclonal Anti-STAT3 （A1192，ABclonal，1/500）;倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司MF53）;顯微鏡（CX41 OLYMPUS）;蛋白垂直電泳儀（DYY-6C，北京市六一儀器廠）;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。

1.3 原代分離大鼠脂肪細(xì)胞：采用斷頸處死SD大鼠，并迅速浸入75%的酒精中，消毒3min。將SD大鼠置于無菌冰板上，使用75%酒精棉球擦拭腹部，采用低位橫向切口打開大鼠腹腔。用鑷子夾住腹股溝處的脂肪，手術(shù)剪將其剪下。將取出的脂肪放于無菌的培養(yǎng)皿中，用含10%的雙抗D-PBS液反復(fù)清洗數(shù)次，再使用無菌手術(shù)剪仔細(xì)剔除附著的組織。把清理好的脂肪組織轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，并用無菌的手術(shù)剪將脂肪組織剪成糜狀。把剪成糜狀的脂肪組織用吸管吸至10ml的離心管中，加入I型膠原酶使其工作濃度為0.1%，并吹打均勻。將離心管置于37℃水浴中消化75min，期間每隔15min吹打1次，具體可視情況而定。加入含20% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 800rpm離心5min，留上層油脂。用含20%胎牛血清、1×雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸上層油脂。將重懸液鋪板，放在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 油紅O染色：去除培養(yǎng)基，加入4%的組織細(xì)胞固定液固定15min;蒸餾水充分清洗，60%異丙醇充分浸潤，油紅染色液染色8min，去除染色液，60%異丙醇快速分化，蒸餾水清洗，蘇木素染色2min，去除染色液，水洗，然后風(fēng)干，甘油明膠封片，顯微鏡觀察。

1.5 OB-RGRP過表達(dá)載體和干擾載體的構(gòu)建：NCBI查找OB-RGRP基因序列，引入酶切位點（EcoRI/XhoI）生物合成基因片段[克隆至pcDNA3.1（+）載體上]。利用軟件分析設(shè)計出最佳的靶序列，同時參考文獻(xiàn)上所用的靶序列，將潛在的靶序列和基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，排除和其他基因編碼序列同源的序列，設(shè)計出siRNA，再交由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成?；蛐蛄幸姳?。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)實驗需要對細(xì)胞鋪12孔板，與細(xì)胞傳代方法相同，將細(xì)胞根據(jù)實驗需要進(jìn)行稀釋，每孔約8×104個細(xì)胞，均勻鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中，做好標(biāo)記，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，且當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，體積為0.5ml;取滅菌的EP管2個，每管加125μl Opti-MEM，其中一管加入5μl lipofectamine 3000，另一個EP管加入12.5μl siRNA（siRNA干粉使用DEPC水溶解;125μl/1OD），混勻后室溫孵育5min;將上述兩個EP管混勻，室溫孵育15min，將混合液分成兩等份滴到12孔板中對應(yīng)的孔內(nèi)，將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng);轉(zhuǎn)染4h后在12孔板中加入血清含量為20%的完全培養(yǎng)基1ml;48h后進(jìn)行PCR驗證。

1.7 實驗分組：①大鼠脂肪細(xì)胞（正常培養(yǎng)細(xì)胞，Control）;②大鼠脂肪細(xì)胞+過表達(dá)空載（轉(zhuǎn)染過表達(dá)空載48h Vector）;③大鼠脂肪細(xì)胞+OB-RGRP過表達(dá)載體（轉(zhuǎn)染過表達(dá)OB-RGRP 48h，OB-RGRP）;④大鼠脂肪細(xì)胞+干擾空載（轉(zhuǎn)染過表達(dá)si-OB-RGRP NC 48h，si-OB-RGRP NC）;⑤大鼠脂肪細(xì)胞+OB-RGRP RNAi慢病毒載體（轉(zhuǎn)染過表達(dá)si-OB-RGRP 48h，si-OB-RGRP）。

1.8 Western blot：取各組細(xì)胞加入相應(yīng)的裂解液中，4℃裂解30min，在10 000rpm/min離心10min，小心吸取上清液，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2h，濕法轉(zhuǎn)膜30～50min。4℃孵育一抗溶液過夜;室溫孵育二抗1～2h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，經(jīng)t檢驗判定顯著性差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 大鼠脂肪細(xì)胞的分離與鑒定：脂肪細(xì)胞剛接種時呈類圓形，懸浮于培養(yǎng)基中，2d后細(xì)胞開始伸展，逐漸成多角梭形;7d左右進(jìn)入指數(shù)增長期，呈漩渦狀。經(jīng)油紅O染色，胞漿內(nèi)的反光顆粒著橘紅色，因此鑒定細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。見圖1。

2.2 干擾驗證：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后與對照組相比，si-B-RGRP NC組、si-B-RGRP組綠色熒光表達(dá)顯著增多，表明這兩個組分成功轉(zhuǎn)染si-B-RGRP NC與si-B-RGRP，慢病毒干擾載體構(gòu)建成功。見圖2。

2.3 干擾與過表達(dá)Western blot驗證：與對照組相比，過表達(dá)OB-RGRP組的OB-RGRP表達(dá)明顯升高，干擾OB-RGRP組的OB-RGRP表達(dá)明顯下降。見圖3。

2.4 各組細(xì)胞JAK2、STAT3表達(dá)情況：JAK2、STAT3總蛋白各組之間無差異，但與對照組相比，過表達(dá)OB-RGRP組的p-JAK2/JAK2與p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯升高，干擾OB-RGRP組的p-JAK2/JAK2與p-STAT3/STAT3表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

3 ?討論

肥胖患者機(jī)體瘦素水平較正常人較低或是瘦素受體表達(dá)量較低，導(dǎo)致瘦素與瘦素受體不能夠有效的結(jié)合，從而不能夠有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)的能量代謝，導(dǎo)致肥胖相關(guān)的癥狀[6]。本研究成功分離大鼠原代脂肪細(xì)胞，并通過油紅O染色鑒定為脂肪細(xì)胞，構(gòu)建OB-RGRP過表達(dá)載體與干擾siRNA并成功驗證其有效。通過Western blot檢測JAK2、STAT3及其磷酸化水平確定OB-RGRP的功能及其不同水平對機(jī)體的影響。

JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有廣泛的生理作用，參與機(jī)體的生長，發(fā)育和免疫活動，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)其與肥胖疾病關(guān)系密切，有研究表明機(jī)體瘦素通過介導(dǎo)JAK2/STAT3信號通路參與脂肪和能量代謝，促進(jìn)機(jī)體分解和利用各種能量物質(zhì)，維持自身代謝平衡[7-8]。根據(jù)本研究結(jié)果瘦素受體（OB-RGRP）水平也能通過介導(dǎo)JAK2/STAT3信號通路實現(xiàn)對肥胖的調(diào)控，過表達(dá)的OB-RGRP促進(jìn)JAK2/STAT3的磷酸化，致使抑制瘦素調(diào)控脂肪代謝，誘發(fā)肥胖[9-10]，而低表達(dá)的OB-RGRP能夠使JAK2/STAT3的磷酸化降低，從而促進(jìn)瘦素調(diào)控脂肪代謝，抑制肥胖的發(fā)生[11-12]。

瘦素受體有六種異形體，廣泛存在于下丘腦、骨骼肌及脂肪組織等。有研究表明，瘦素可以透過血腦屏障直接作用于下丘腦內(nèi)的瘦素受體，將外周能量存貯相關(guān)信號反饋至下丘腦[13]，下丘腦調(diào)節(jié)能量平衡的通路為刺鼠相關(guān)蛋白（agouti-related peptide，AgRP）神經(jīng)元/阿黑皮素原（proopiomelanocortin，POMC）神經(jīng)元通路，維持能量平衡[14-15]。因此瘦素或瘦素受體的不足，也可能會抑制AgRP/POMC通路，導(dǎo)致脂肪能量不能正常消耗而產(chǎn)生肥胖。

肥胖的誘發(fā)因素多種多樣，因人而異，因此關(guān)于肥胖慢性疾病的產(chǎn)生機(jī)理眾說紛紜。目前筆者只對JAK2/STAT3信號通路做了簡要的研究，更加錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究和闡明。

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[收稿日期]2019-03-12

本文引用格式：李小林，巫國輝，萬冠群，等.瘦素受體（OB-RGRP）水平對脂肪細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（11）：90-93.