關(guān)勝 曹林升 徐皖江 蔡萬松 孟繁華 葉李銀

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。隨著人類發(fā)展指數(shù)的上升和社會(huì)老齡化加劇，我國前列腺癌發(fā)病率逐年上升[1]。前列腺癌起病隱匿，早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期。因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期治療至關(guān)重要[2]。前列腺特異抗原（PSA）是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的前列腺癌生物標(biāo)志物[3]。但它作為前列腺癌的生物標(biāo)志物尚存在不足，如本身缺乏足夠的特異性，早期診斷前列腺癌的靈敏度和特異度不理想[4]。miR-221是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)小RNA分子，在惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。本研究通過檢測前列腺癌患者、健康體檢者和良性前列腺增生（BPH）患者血清miR-221表達(dá)水平，探討其與臨床特征的關(guān)系及診斷價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年1月至2016年12月在杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院泌尿外科就診的118例前列腺癌患者，年齡55~79（67.4±5.2）歲；接受全雄激素阻斷治療（MAB）治療78例，前列腺癌根治性手術(shù)治療31例，根治性放療9例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)前列腺穿刺活檢或術(shù)后病理報(bào)告確診為前列腺癌；（2）無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）入院前未接受過任何針對前列腺癌的治療；（4）患者或家屬簽署知情同意書；（5）經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重的肝、腎、腦、肺等疾?。唬?）合并其他惡性腫瘤；（3）患有嚴(yán)重的急慢性感染性疾病。另取30例健康體檢者為健康組，30例BPH患者作為BPH組。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 使用橘黃色促凝采血管采集患者全血，翻轉(zhuǎn)采血管，混合血液4~5次，使血液和促凝劑混合均勻。4℃環(huán)境溫度下將采血管直立至血液完全凝固，1 000g條件下離心10min，分離血清。分裝血清樣本，液氮速凍，置于-80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 血清miR-221水平檢測 采用RT-PCR法?？俁NA抽提：使用Trizol試劑（美國Gibco公司）提取血清樣本總RNA。每200μl血清樣本中加入3倍體積的Trizol試劑進(jìn)行裂解。經(jīng)過RNA沉淀、洗滌、溶解后，使用Agilent 2100生物分析儀（美國安捷倫科技有限公司）測量提取RNA的完整性，NanoDropND-1000（美國NanoDrop公司）測量提取RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟進(jìn)行，將RNase Free的反應(yīng)管在0℃條件下預(yù)冷，然后內(nèi)構(gòu)建反應(yīng)體系：RNA 3μl，mirVana RT Buffer（5×）2μl，1×mirVana RT Primer 1μl，Array script Enzyme Mix 0.4μl，加 RNasefree 水至總體積 10μl。反應(yīng)條件：42℃ 60min，95℃5min，4℃急速降溫。PCR反應(yīng)按照 miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟進(jìn)行：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4μl，50 ×ROX Reference Dye 0.4μl，PCR Forward Primer（20×）1μl，PCR Reverse Primer（20×）1μl，1×cDNA 模板

1~2.5μl，加入ddH2O至總體積20μl。PCR反應(yīng)條件：95°C 15min；95℃ 5s，60℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-221相對表達(dá)量。miR-221引物序列：正向5′-GTTCGTGGGAGCTACATCTGGC-3′，反向 5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6 引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。血清miR-221相對表達(dá)量與血清PSA水平的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。繪制ROC曲線分析血清miR-221相對表達(dá)量對前列腺癌的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清RNA提取質(zhì)量分析 所有對象血清樣品中提取RNA的 A260/A280為1.96，28S和 18S核糖體 RNA電泳條帶清晰明亮，其中28S條帶強(qiáng)度約為18S條帶的

2倍。這表明提取的血清總RNA完整性良好，無降解，滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.2 3組對象血清miR-221相對表達(dá)量比較 健康組、BPH組和前列腺癌組血清miR-221相對表達(dá)量分別為 0.19±0.03、0.27±0.05 和 0.57±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中前列腺癌組明顯高于健康組、BPH組（均P＜0.05），BPH 組高于健康組（P＜0.05），見圖 1。

圖1 3組對象血清m i R-221相對表達(dá)量比較

2.3 血清miR-221相對表達(dá)量與前列腺癌臨床特征的關(guān)系 不同血清PSA水平、Gleason評分、病理分期、臨床分期的前列腺癌患者血清miR-221相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同確診年齡的前列腺癌患者血清miR-221相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 血清m i R-221相對表達(dá)量與前列腺癌臨床特征的關(guān)系

2.4 血清miR-221相對表達(dá)量與血清PSA水平的相關(guān)性 118例前列腺癌患者血清miR-221相對表達(dá)量與血清PSA水平呈正相關(guān)（r=0.47，P＜0.05），見圖2。

圖2 血清m i R-221相對表達(dá)量與血清P S A水平的散點(diǎn)圖

2.5 血清miR-221相對表達(dá)量診斷前列腺癌的價(jià)值血清miR-221相對表達(dá)量診斷前列腺癌的AUC為0.738（95%CI：0.714~0.885，P＜0.01）；截?cái)嘀禐?0.577時(shí)，血清miR-221相對表達(dá)量診斷前列腺癌的靈敏度為0.786，特異度為 0.645，見圖 3。

圖3 血清m i R-221相對表達(dá)量診斷前列腺癌的R O C曲線

3 討論

miR-221是位于人類X染色體p11.3的一種內(nèi)源性的、非編碼的單鏈小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在甲狀腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中均呈異常高表達(dá)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-221能靶向作用于 p27/Kip1、p57、BH3-only、ER-α、FOXO3、PTEN、TIMP3、DDIT4等抑癌基因，繼而激活細(xì)胞周期和AKT旁路或阻斷TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，最終發(fā)揮類似于致癌基因的效能來調(diào)控與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)過程[10-13]。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中miR-221過表達(dá)，可明顯增加其神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌樣改變；提示miR-221在前列腺癌神經(jīng)內(nèi)分泌化進(jìn)程中起著促進(jìn)作用。Sun等[15]發(fā)現(xiàn)miR-221高表達(dá)，可使LNCaP細(xì)胞的生長不受雄性激素的影響。通過系統(tǒng)的生化和生物信息學(xué)分析，確定Hectd2、Rab1A是miR-221的兩個(gè)靶點(diǎn)。其中Hectd2下調(diào)會(huì)影響雄性激素/受體誘導(dǎo)和介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，而抑制Hectd2或Rab1A會(huì)促進(jìn)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖；提示miR-221高表達(dá)可以介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞向CRPC表型的發(fā)展。Kneitz等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221不僅能直接抑制SOCS3和IRF2的表達(dá)，而且可以通過Stat1/Stat3介導(dǎo)的激活JAK/Stat信號(hào)通路來調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生長、凋亡和侵襲；該研究結(jié)果提示，在高危前列腺癌中，miR-221是癌癥相關(guān)死亡的獨(dú)立預(yù)測因子，可能為前列腺癌治療與預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

目前研究認(rèn)為miR-221是高危前列腺癌的生物標(biāo)志物，但是其作為前列腺癌腫瘤標(biāo)志物的臨床意義仍有待進(jìn)一步探討。Teixeira等[17]對77例腎細(xì)胞癌患者血液循環(huán)中的miR-221進(jìn)行相對定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌患者血液循環(huán)中miR-221表達(dá)異常高于健康者，且miR-221高表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及總體生存率相關(guān)。冀宏等[18]檢測甲狀腺癌組織中miR-221表達(dá)，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析；結(jié)果顯示miR-221表達(dá)水平與甲狀腺癌病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究比較了前列腺癌患者、BPH患者和健康體檢者血清miR-221相對表達(dá)量，結(jié)果顯示前列腺癌組明顯高于健康組、BPH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清miR-221相對表達(dá)量與前列腺癌患者血清PSA水平、Gleason評分、病理分期、臨床分期等有關(guān)。PSA是臨床上最常用的前列腺癌生物標(biāo)志物，它在前列腺癌早期診斷和治療檢測中具有重要的臨床意義[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-221相對表達(dá)量與血清PSA水平呈正相關(guān)。繪制ROC曲線評估血清miR-221相對表達(dá)量對前列腺癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示AUC值為0.738；取截?cái)嘀禃r(shí)的靈敏度為0.786，特異度為0.645；提示miR-221相對表達(dá)量越高，患前列腺癌的可能性越大。

綜上所述，前列腺癌患者血清miR-221表達(dá)明顯升高，與其臨床特征密切相關(guān)。血清miR-221高表達(dá)對前列腺癌具有一定的診斷價(jià)值。由于miRNA具有調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)基因的能力，未來可在miR-221的基礎(chǔ)上開展針對前列腺癌的靶向治療研究。