郁桂聰 孫新軍 穆長青 趙鳳娟

摘要：指出了類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，在食品與醫(yī)學(xué)上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。紅酵母是其重要的微生物菌種來源，因其生產(chǎn)要求簡單、發(fā)酵周期短且發(fā)酵工藝易于調(diào)控，具有較好的規(guī)?；囵B(yǎng)潛力而備受關(guān)注。實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了1株紅酵母，提取其油脂，并運(yùn)用HPLC法對(duì)其類胡蘿卜素進(jìn)行了分離、鑒定及定量分析。結(jié)果成功分離鑒定出4種胡蘿卜素，即β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素和圓酵母素，并測(cè)得了其在每克油脂中的含量分別為：48ug、60ug、206ug、544ug，在每克干茵體中的含量分別為23ug、29ug、98ug、259ug，實(shí)現(xiàn)了對(duì)紅酵母類胡蘿卜素的定性及定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為紅酵母提取類胡蘿卜素工藝參數(shù)的優(yōu)化與優(yōu)良產(chǎn)油紅酵母種質(zhì)資源的篩選提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅酵母;類胡蘿卜素;高效液相色譜法（HPLC）

中圖分類號(hào)：TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）18-0171-03

1引言

類胡蘿卜素（carotenoid）一般為C40的萜結(jié)構(gòu)的較為多見，在空氣中不穩(wěn)定，容易被氧化，但類胡蘿卜素可以作為食品添加劑和營養(yǎng)品，同時(shí)在醫(yī)學(xué)方面也具有很大價(jià)值，例如：預(yù)防血管硬化、抑制腫瘤發(fā)生、增加宿主免疫力和抗氧化等功能等，因而備受關(guān)注。紅酵母作為生產(chǎn)類胡蘿卜素的主要菌種來源，其發(fā)酵周期短和營養(yǎng)需求較低，生產(chǎn)過程易于調(diào)控，培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)較為成熟，所以應(yīng)用紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素具有很高的應(yīng)用價(jià)值和較好的開發(fā)前景。

類胡蘿卜素是一種發(fā)酵胞內(nèi)色素，而酵母細(xì)胞壁厚不易破損，所以使得紅酵母提取類胡蘿卜素具有一定困難。在酵母細(xì)胞壁破碎眾多方法中，酸熱法是最為常見破碎細(xì)胞壁的方法。HPLC法是高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography）的簡稱，是色譜法的一個(gè)重要分支，它是利用液體作為流動(dòng)相，將具有不同極性溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入到裝有固定相的色譜柱。利用色譜柱與不同類胡蘿卜素的結(jié)合能力不同，使得各種類胡蘿卜素通過色譜柱時(shí)間不同，繼而使各種類胡蘿卜素得以分離和鑒定。

本研究應(yīng)用酸熱法提取紅酵母油脂后，選用HPLC對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析，期望為紅酵母提取類胡蘿卜素提供一些技術(shù)參考，也為將來規(guī)模化生產(chǎn)中優(yōu)良產(chǎn)油紅酵母種質(zhì)的篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

紅酵母材料來源于戴維斯種質(zhì)庫，菌種編號(hào)05-736，其不同培養(yǎng)狀態(tài)見圖l。經(jīng)平板活化培養(yǎng)和三角瓶振蕩培養(yǎng)所得紅酵母發(fā)酵液，加以離心，收獲菌體沉淀物，置于培養(yǎng)皿中放到恒溫干燥箱中于50℃條件下烘干2h待用。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1酸熱法提取油脂

①準(zhǔn)確稱取3份干菌體樣品每份1.000g分別裝入到3支試管。②加入6mL濃度為3mol/L鹽酸于各試管中，然后充分混勻，靜置30min后，再放于98℃恒溫水浴鍋中。③把上述的試管分別加入8mL的石油醚與丙酮比例為20：1溶液。④再把試管放于混勻器上充分混勻，放人離心管中，4000r/min離心20min。⑤取上清液放置到干燥的進(jìn)樣瓶中，氮吹儀吹干，稱重。

2.2.1HPLC分離鑒定和量化類胡蘿卜素

（1）流動(dòng)相配置：流動(dòng)相（A）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸餾水比例為（83：15：2），再加入3.9mL醋酸銨;流動(dòng)相（B）：100L甲醇和甲基叔丁基醚和蒸餾水比例為（8：90：2），再加人2.6mL醋酸銨。

（2）流動(dòng)相釋放時(shí)間及比例，見表1。

（3）色譜柱規(guī)格為聚合色譜柱型號(hào)為C30，3um，150mm。

2.2.3油脂與類胡蘿卜素稱重與計(jì)算

（1）油脂稱重與計(jì)算。將進(jìn)樣瓶編號(hào)稱重，記為m1（g）（精確度0.001）;用氮?dú)獯蹈裳b有油脂的進(jìn)樣瓶后，稱重其重量記為m2（g）（精確到0.001）;油脂提取的計(jì)算公式：粗油脂重量M=m2-m1，則紅酵母產(chǎn)油率的計(jì)算公式：

Y=M/S×100%（1）

式（1）中：M=粗油脂質(zhì)量（g）;y=粗油脂含量（%），S=為紅酵母干菌體質(zhì)量（g）。

（2）類胡蘿卜素鑒定與計(jì)算。利用高效液相色譜儀，根據(jù)4種類胡蘿卜素保留時(shí)間不同，在計(jì)算機(jī)上所形成的峰值段與時(shí)間軸圍成的面積，與各類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)的峰面積比對(duì)，分析計(jì)算各種類胡蘿卜素的種類及含量。

3結(jié)果與分析

3.1HPLC體系中8種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間

8種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間見表2。

3.2目標(biāo)紅酵母類胡蘿卜素種類的分離及鑒定

由目標(biāo)紅酵母05-736經(jīng)HPLC所得的色譜圖（圖2）可見，一共有7個(gè)有效峰值，其中在4.136min、23.756min、27.002min這三個(gè)時(shí)間段，不能確定是類胡蘿卜素。而在17.483min、23.304min、26.192min、29.253min這四個(gè)時(shí)間段，對(duì)應(yīng)了4種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間，從而鑒定其分別為：β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素、圓酵母素。

3.3目標(biāo)紅酵母油脂與類胡蘿卜素的定量分析

從表3可看出目標(biāo)紅酵母的粗油脂得率為51.21±3.59%;而其中β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素、圓酵母素的含量依次增高，與圖2中所展示的四種類胡蘿卜素峰值段圍成的面積大小相符。與已有研究報(bào)道相比，該紅酵母在油脂含量和類胡蘿卜素含量上均表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。

4結(jié)論

通過HPLC對(duì)目標(biāo)紅酵母菌株類胡蘿卜素進(jìn)行了分離鑒定，成功鑒定出4種胡蘿卜素，即β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、紅酵母紅素和圓酵母素，并測(cè)得其在每克油脂中的含量分別為：48ug、60ug、206ug、544ug。在每克干菌體中的含量分別為23ug、29ug、98ug、259ug，實(shí)現(xiàn)了對(duì)該目標(biāo)紅酵母菌株類胡蘿卜素的定性及定量分析，本研究可為紅酵母提取類胡蘿卜素工藝參數(shù)的優(yōu)化與優(yōu)良紅酵母種質(zhì)資源的篩選奠定基礎(chǔ)。