梁真潔,潘俊慧,于曉菲,陳普成,曾顯營,柳金雄,施建忠,鄧國華,姜永萍,陳化蘭
(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室,哈爾濱黑龍江150069)
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)能夠感染包括家禽在內(nèi)的多種鳥類,引起其嚴重的致死性疾病。H7N9 禽流感在2013年初引起多次人感染疫情,在2017年演變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲?,不僅引發(fā)了嚴重的人類公共衛(wèi)生安全,也給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[1]。我國于2017年9 月在全國范圍內(nèi)進行了家禽H7N9 疫苗免疫接種,極大地降低了家禽中H7N9 病毒的復制和傳播,更有效阻斷了病毒由禽向人的傳播。但研究顯示,新出現(xiàn)的H7N9 高致病性病毒進化迅速,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在鴨子中新出現(xiàn)了具有致病性的H7N9 和H7N2 病毒,這為H7N9 禽流感的防控帶來了新的挑戰(zhàn)[2-3]。
HA 蛋白是流感病毒囊膜纖突的重要組成部分,是其表面最重要的糖蛋白之一。它是流感病毒粒子表面最主要的成分,除了在與受體結(jié)合、融合、包裝及致病性方面發(fā)揮重要作用外,還是宿主獲得性免疫系統(tǒng)識別的主要對象。流感病毒感染宿主后,會誘導其產(chǎn)生強烈的免疫反應,導致中和抗體的產(chǎn)生[4]。因此,HA 蛋白是流感病毒疫苗研制的主要靶抗原。
禽流感防控實踐表明,疫苗免疫是最有效的防控禽流感的措施之一。禽流感DNA 疫苗較傳統(tǒng)疫苗相比具有許多優(yōu)點:疫苗的制備工藝簡單,便于大批量生產(chǎn);質(zhì)粒DNA 在2 ℃~8 ℃性能穩(wěn)定,便于運輸和儲存;免疫原性強,能夠同時激活細胞免疫和體液免疫;僅表達HA 基因,免疫后能夠與感染雞進行鑒別,不影響疾病的流行病學普查。因此很有必要研制H7N9 DNA 疫苗,為H7N9 禽流感的防控提供有益和必要的技術支撐[5]。本研究首先構(gòu)建含H7N9 AIV HA 的重組質(zhì)粒,并對其進行IFA和western blot 鑒定,最后經(jīng)動物實驗來評價該質(zhì)粒的免疫效力。為H7N9 的防控提供良好的物質(zhì)基礎。
1.1 質(zhì)粒、病毒株和細胞系pCAGGs 載體、攻毒用高致病性AIV (HPAIV)CK/GX/SD098/17 (H7N9)株和低致病性AIV (LPAIV)CK/CQ/SD057/17(H7N9)株及其標準抗原和相對應的雞抗H7N9 AIV 多克隆抗體、293T 細胞均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室保存;E.coliDH5α 感受態(tài)細胞購自北京TransGen 公司。
1.2 主要試劑Q5 高保真酶和內(nèi)切酶EcoRⅠ/XhoⅠ購自 NEB 公司;Lipofectamine 3000 LTX 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司;兔抗雞IgG-FITC 熒光二抗購自life 公司;兔抗GAPDH 單克隆抗體(MAb)購自Santa CruzBiotechnology 公司;驢抗雞 Ig (H+L)-Dlight800 抗體購自Odyssey 公司;引物由庫美公司合成。
1.3 H7N9 AIV HA 基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將H7N9 AIV HA 基因的密碼子優(yōu)化為雞體所偏嗜的密碼子,并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。優(yōu)化的HA 基因經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后定向克隆至pCAGGs 載體,構(gòu)建的重組質(zhì)粒采用載體引物進行PCR 鑒定,采用EcoRⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ以及pstⅠ酶切鑒定且測序鑒定后,命名為pCASD098。
1.4 H7N9 AIV HA 蛋白的間接免疫熒光檢測(IFA)待293T 細胞狀態(tài)良好、密度約為8×105個/mL 時,用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCA-SD098,并同時設立載體質(zhì)粒pCAGGS 對照組。轉(zhuǎn)染48 h,經(jīng)固定處理后,以雞抗H7N9 AIV 多克隆抗體(1∶300)為一抗,兔抗雞IgG-FITC (1∶1 000)為二抗,經(jīng)IFA檢測H7N9 AIV HA 蛋白的表達情況。
1.5 H7N9 AIV HA 蛋白的western blot 鑒定將重組質(zhì)粒pCA-SD098 及對照質(zhì)粒pCAGGs 分別轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好、密度約為8×105個/mL 的293T 細胞,同樣用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染 293T 細胞,轉(zhuǎn)染 48 h 后收集樣品,經(jīng)RIPA 裂解,以H7N9 AIV 多克隆抗體(1∶500)為一抗,以驢抗雞 IgG-Dlight800 (1∶5 000)為二抗, western blot 鑒定HA 蛋白的表達情況,并以GAPDH 的表達作為293T 細胞基因正常表達的對照。
1.6 重組質(zhì)粒pCA-SD098 的免疫效力評價
1.6.1 SPF 雞的免疫試驗設計 將重組質(zhì)粒pCA-SD098 以肌肉注射方式免疫3 周齡SPF 雞,免疫以及分組情況見表1,并在首次免疫后每周采集免疫及對照雞血,用紅細胞凝集抑制試驗(HI)檢測其中的HI 抗體水平。
表1 SPF 雞的免疫分組情況Table 1 The groups of immunized SPF chickens
1.6.2 攻毒保護實驗 加強免疫一周后,分別經(jīng)鼻腔途徑感染105EID50CK/GX/SD098/17 (H7N9)和CK/CQ/SD057/17 (H7N9),攻毒之后的觀察期為10 d,每天查看和記錄免疫雞以及對照雞的發(fā)病和死亡情況。
1.6.3 病毒的分離 攻毒后第3 d、第5 d 和第7 d無菌采集所有SPF 雞喉頭和泄殖腔拭子,并用加雙抗的PBS 做10 倍倍比稀釋,每個稀釋度接種3 枚10 日齡SPF 雞胚,48 h 之后,檢測SPF 雞胚尿囊液的HA 效價,并按照Reed&Muench 法計算分離病毒的滴度。
2.1 重組質(zhì)粒pCA-SD098 的構(gòu)建及鑒定利用雙酶切以及定向克隆的方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCA-SD098。將重組質(zhì)粒pCA-SD098 使用載體引物進行PCR 鑒定,結(jié)果顯示所得條帶均正確(圖1),并且測序結(jié)果與預期完全符合。表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCA-SD098。
2.2 目的蛋白表達的IFA 檢測結(jié)果將重組質(zhì)粒pCA-SD098、空載體 pCAGGs 轉(zhuǎn)染 293T 細胞 48 h之后,通過IFA 檢測目的蛋白的表達。結(jié)果顯示,pCA-SD098 轉(zhuǎn)染的細胞有綠色熒光,而空載體無綠色熒光(圖2),表明H7N9 HA 蛋白在 293T 細胞中得到了表達。
圖1 重組質(zhì)粒pCA-SD098 的PCR 鑒定Fig.1 Identification of pCA-SD098 by PCR
圖2 HA 蛋白在293T 細胞中表達的 IFA 檢測Fig.2 Identification of the expressed HA in 293T cells by IFA
2.3 目的蛋白表達的western blot 鑒定將重組質(zhì)粒pCA-SD098、空載體pCAGGs 轉(zhuǎn)染293T 細胞48 h之后進行western blot 鑒定。結(jié)果顯示,在約73 ku處有特異性條帶,與預期HA 蛋白大小相符,對照組無該條帶(圖3)。表明,HA 蛋白在293T 細胞中得到了表達,且該蛋白具有較好的反應原性。
圖3 目的蛋白在293T 細胞中表達的western blot 鑒定Fig.3 Identification of expressed HA protein by western blot
2.4 重組質(zhì)粒pCA-SD098 的免疫效力評價
2.4.1 重組質(zhì)粒免疫以及攻毒后的SPF 雞HI 抗體水平的檢測結(jié)果 加強免疫前,免疫雞產(chǎn)生的HI抗體水平相對比較低。加強免疫后一周,15 μg/ 只免疫雞的HI 抗體水平最高可達到1∶32;20 μg/只免疫雞產(chǎn)生的HI 抗體水平最高可達到1∶64。在攻毒后,所有免疫雞的HI 抗體水平顯著上升(圖4)。表明重組質(zhì)粒pCA-SD098 免疫后可以誘導SPF 雞產(chǎn)生較高水平的HI 抗體,且20 μg/ 只免疫SPF 雞誘導的HI 抗體水平高于15 μg/ 只免疫SPF 雞誘導的HI抗體水平。
圖4 免疫雞HI 抗體檢測結(jié)果Fig.4 HI antibodies induced by pCA-SD098
2.4.2 攻毒后SPF 雞發(fā)病、死亡情況與病毒分離首次免疫后28 d,用致死劑量105EID50的HPAIV CK/GX/SD098/17(H7N9)攻毒后,所有免疫雞無發(fā)病,無死亡,無排毒,而對照組雞在攻毒后均有排毒并在攻毒后6 d 內(nèi)全部死亡。
在用LPAIV CK/CQ/SD057/17(H7N9)攻毒后,免疫15 μg/ 只pCA-SD098 組有少數(shù)雞可檢測到排毒,但均無發(fā)病、無任何臨床癥狀,20 μg/ 只免疫組雞在攻毒后均無發(fā)病、無排毒,對照組雞可見眼瞼腫脹,且均排毒(表2)。上述結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pCA-SD098 15 μg/ 只免疫雞可以使其對致死性同源病毒的攻擊提供100 %的保護,重組質(zhì)粒20 μg/ 只免疫雞可以使其對異源病毒的攻擊提供100 %的保護。
表2 SPF 雞攻擊H7N9 AIV 后的排毒檢測結(jié)果Table 2 Virus shedding from SPF chickens infected with H7N9 AIV
2013年初,我國發(fā)生人感染H7N9 流感病毒的疫情,并在2013年~2018年間連續(xù)引起了5 波感染人的疫情。2017年發(fā)現(xiàn)H7N9 病毒在HA 基因的裂解位點插入了4 個堿性氨基酸,使得H7N9 AIV由不引起家禽發(fā)病的低致病性病毒演變?yōu)楦咧虏⌒圆《?,并相繼在家禽中引起了8 起疫情[2-3]。不僅引發(fā)了嚴重的人類公共衛(wèi)生安全,也給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[6-7]。因此,H7N9 禽流感的防控具有很大的挑戰(zhàn)性。自2017年9 月份以來,全國范圍內(nèi)H5/H7 二價滅活疫苗免疫的普及,有效阻斷了H7N9 病毒在家禽中的流行,降低了活禽市場和養(yǎng)殖場H7N9 病毒的污染面和污染程度,從而阻斷了人感染H7N9 病例的發(fā)生[8-9]。
DNA 疫苗作為新型的疫苗逐步走入市場,本實驗前期已構(gòu)建含雞偏嗜性密碼子的H5 亞型AIV HA基因表達載體,這一重組質(zhì)粒免疫SPF 雞后能夠誘導其產(chǎn)生高水平的HI 抗體[10-12]。本研究按照雞的偏嗜性對HPAIV SD098 (H7N9)株的HA 基因進行優(yōu)化并合成,同時將HA 片段插入到pCAGGs 載體中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCA-SD098。
將重組質(zhì)粒pCA-SD098 轉(zhuǎn)染293T 細胞,通過IFA 和 western blot 檢測到HA 蛋白能夠在 293T 細胞中瞬時表達,且表達的HA 蛋白具有良好的反應原性,可以作為靶抗原為后續(xù)的動物實驗提供保護。
為評價pCA-SD098 的免疫保護效果,本研究進行了動物免疫保護實驗,將該質(zhì)粒以15 μg/ 只免疫SPF 雞后,其可以抵御致死劑量的同源HPAIV CK/GX/SD098/17 (H7N9)病毒的攻擊,但僅能降低異源LPAIV CK/CQ/SD057/17 (H7N9)感染后的病毒載量;以20 μg/只的劑量免疫后,可以有效阻止異源LPAIV CK/CQ/SD057/17 (H7N9)在雞體內(nèi)的復制。表明構(gòu)建的質(zhì)粒DNA 對親本病毒可以提供100 %的保護,并對異源病毒可以提供交叉保護。
DNA 疫苗是未來人和動物預防與治療相關疫病的重要技術發(fā)展方向之一,當DNA 疫苗通過肌肉注射的方式進入雞體內(nèi),肌細胞就會表達目的蛋白并釋放相應的抗原多肽。該抗原被抗原提呈細胞(APC)吞噬并遞呈給MHCⅠ類和MHCⅡ類分子,從而啟動CD8+T 和CD4+T 淋巴細胞[13],誘導全面的體液和細胞免疫反應。因此,本研究構(gòu)建的H7N9 禽流感DNA 疫苗可以作為防控H7N9 AIV 的候選疫苗之一。