顏欣欣，杭建雄，劉云秋，黃 岳，冉榮坤，趙 琪，何 龍，李 秀，劉菊玫，李國清

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

錫蘭鉤蟲(Ancylostoma ceylanicum)是寄生于犬、貓的常見鉤蟲，也是唯一能在人體內(nèi)發(fā)育為成蟲的動物源性鉤蟲，可以引起犬、貓和人的鉤蟲病，主要癥狀為缺鐵性貧血，感染嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡[1]。據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查，錫蘭鉤蟲是導(dǎo)致人鉤蟲病的第二大病原，同時也是東南亞和西太平洋地區(qū)旅行者腹瀉的重要病原體[2-3]，且犬、貓是重要的保蟲宿主[4-5]。目前，使用化學(xué)藥物驅(qū)蟲仍然是控制鉤蟲病的重要手段，但由于鉤蟲的耐藥性和重復(fù)感染，藥物防治未能取得良好效果[6]。因而，迫切需要尋找新的控制方法。

金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)的特異性抑制劑。TIMP 與MMP結(jié)合，抑制TIMP 的蛋白水解活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動[7]。迄今為止，已經(jīng)報道了人、果蠅、犬鉤蟲等生物的TIMP[8-12]。關(guān)于錫蘭鉤蟲TIMP(Ace-TIMP)雖有文獻(xiàn)提及[13]，但未見對Ace-TIMP 的研究報道。本研究旨在對Ace-TIMP 基因進(jìn)行克隆、原核表達(dá)與序列分析，為進(jìn)一步研究Ace-TIMP 的生物學(xué)功能及其免疫潛能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體、菌株及主要試劑本研究所用的錫蘭鉤蟲采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)犬，經(jīng)蟲種鑒定后置于RNA 樣品保存液中-20 ℃保存。E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞和pMD18-T 載體、EcoRⅠ、HindⅢ、DL2000 DNA Marker 購自TaKaRa 公司；E.coliTransetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-32a 載體由本教研室保存。TRIzol試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；RNA 樣品保存液購自廣州鼎國公司；蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；鼠抗His 標(biāo)簽抗體和兔抗鼠IgG-HPR 抗體購自生工生物工程(上海)有限公司；His 標(biāo)簽純化試劑盒、明膠、考馬斯亮藍(lán)G-250 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人MMP-2 蛋白購自上海Novoprotein 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 登錄的Ace-TIMP 基因序列(ANCCEY-04405)設(shè)計(jì) 1 對引物，TIMP-AF：5'-CCGGAATTCATGCTCTTCCTTATAGTTTTC-3'(EcoR Ⅰ )/ TIMP-AR： 5'-CCCAAGCTTCTAGTCCAC GCTTTCCTCTT-3' (Hind Ⅲ )。 根 據(jù) Ace-TIMP 基 因測序結(jié)果設(shè)計(jì)1 對引物擴(kuò)增TIMP 成熟肽序列，TIMP-MP-AF：5'-CCGGAATTCGCATGCTCTTGCGA ACCGTAC-3'(EcoRⅠ)/ TIMP-MP-AR：5'-CCCAAGC TTGTCCACGCTTTCCTCTTCACT-3' (Hind Ⅲ)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 TIMP 基因的 RT-PCR 擴(kuò)增、克隆及測序TRIzol 法抽提錫蘭鉤蟲成蟲總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 為模板。以 TIMP-AF/TIMP-AR 為引物，PCR 擴(kuò)增 Ace-TIMP 基因。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。純化 PCR 產(chǎn)物，克隆于pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，PCR 鑒定為陽性的菌落樣品由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，命名為pMD18-T-TIMP。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)以TIMP-MP-AF/TIMP-MP-AR 為引物，pMD18-T-TIMP重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增TIMP 成熟肽序列克隆至pET-32a 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-TIMP-MP，雙酶切鑒定。陽性重組菌培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 在28 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物離心后棄上清收集菌體，超聲破碎，收集上清與沉淀，用SDS-PAGE 分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.5 Ace-TIMP 重組蛋白的純化與western blot 分析采用鎳柱純化法純化超聲破碎上清，獲取目的蛋白。在12 %聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。以鼠抗His 標(biāo)簽抗體(1 ∶1 000)為一抗，以兔抗鼠IgG-HPR (1∶20 000)為二抗，western blot 檢測表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物的特異性。

1.6 Ace-TIMP 重組蛋白對MMP-2 的抑制活性檢測采用底物酶譜法[14]分析Ace-TIMP 對MMP-2 蛋白的抑制活性，配制含有1 %明膠與1 %人MMP-2蛋白的SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行非變性凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250 染色、脫色，拍照保存結(jié)果。

1.7 TIMP 基因的序列分析利用DNAMAN 軟件翻譯TIMP 基因的氨基酸序列并對其進(jìn)行多重比對；利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建TIMP 氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 TIMP 基因的擴(kuò)增與鑒定以犬源錫蘭鉤蟲cDNA 為模板，利用引物 TIMP-AF/TIMP-AR 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得一條約650 bp 的條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖1)?；厥?PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆于pMD18-T 載體，經(jīng)菌液PCR 鑒定為陽性。表明，正確擴(kuò)增了犬源Ace-TIMP 基因。

圖1 Ace-TIMP 基因的 PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Ace-TIMP gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定、表達(dá)與重組蛋白活性的分析EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Ace-TIMP-MP，電泳結(jié)果顯示在約597 bp處有目的條帶(圖2A)，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 分析上清與沉淀，結(jié)果顯示在42 ku 處(pET-32a 載體標(biāo)簽蛋白約為20 ku)可見特異性條帶(圖2B)，與目的蛋白大小相符。Western blot 分析pET-32a-Ace-TIMP-MP 的表達(dá)產(chǎn)物與純化產(chǎn)物，結(jié)果顯示在約42 ku 處可見特異性條帶(圖2C、2D)，與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量一致。底物酶譜法分析Ace-TIMP 重組蛋白對MMP-2 的抑制活性，結(jié)果顯示在約42 ku 處可見藍(lán)色條帶(圖2E)。表明，正確構(gòu)建了Ace-TIMP 基因的原核表達(dá)載體，該重組蛋白的分子質(zhì)量為42 ku，主要在上清中表達(dá)，為可溶性融合蛋白，且該蛋白可以抑制MMP-2的活性。

2.3 TIMP 基因的序列分析測序結(jié)果顯示Ace-TIMP 基因的ORF 全長為648 bp，編碼215 個氨基酸。其信號肽序列為48 bp，編碼16 個氨基酸；成熟肽序列為597 bp，編碼199 個氨基酸；終止密碼子為TAG。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，Ace-TIMP與犬鉤蟲TMP-2 (Ac-TMP-2)的相似性為56.8 %，具有 TIMP 家族 Cys-X-Cys (18Cys-19Ser-20Cys)特征性序列，且在N 末端結(jié)構(gòu)域中擁有4 個保守的Cys 殘基，2 個保守的 Gly 殘基，1 個保守的 Pro、Val、Tyr 殘基。對不同物種TIMP 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示Ace-TIMP 與Ac-TMP-2 處于同一進(jìn)化分支(圖3)。表明Ace-TIMP 與Ac-TMP-2的遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定(A)、表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析(B)、表達(dá)產(chǎn)物(C)與純化產(chǎn)物(D)的western blot 分析以及Ace-TIMP蛋白對MMP-2 的抑制活性檢測結(jié)果(E)Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid (A), SDS-PAGE analysis of expression product (B), western blot analysis of expressed products (C)and purified products (D), and the inhibitory activity of Ace-TIMP protein to human MMP-2 (E)

圖3 TIMP 遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Genetic and evolutionary analysis of TIMP

TIMP 是MMP 的特異性抑制劑，廣泛存在于脊椎動物與無脊椎動物體內(nèi)。目前，對TIMP 的研究多集中于脊椎動物，對無脊椎動物尤其是寄生蟲TIMP 的研究甚少。在鉤蟲中僅報道犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)的 2 個 TIMP， 即 Ac-TMP-1[10]與Ac-TMP-2[12]。研究表明 Ac-TMP-1 與 Ac-TMP-2 具有典型的Cys-X-Cys 功能位點(diǎn)，缺乏與哺乳動物TIMP對應(yīng)的C 末端結(jié)構(gòu)域[10-12]。本研究擴(kuò)增了犬源錫蘭鉤蟲Ace-TIMP 基因，通過序列比對分析顯示Ace-TIMP 與 Ac-TMP-2 的相似性最高(56.8 %)，含有TIMP 家族特有的Cys-X-Cys 功能位點(diǎn)，缺乏C末端結(jié)構(gòu)域，這與犬鉤蟲TIMP 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相符[10-12]。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，來自人、鼠、犬與黑腹果蠅的TIMP 聚為一支，錫蘭鉤蟲TIMP 與犬鉤蟲的TMP-2聚為一支，這與Brew 和Nagase 關(guān)于哺乳動物的TIMP 家族起源于黑腹果蠅以及單一結(jié)構(gòu)域TIMP 分子可能由雙結(jié)構(gòu)域TIMP 缺失一個結(jié)構(gòu)域進(jìn)化而來的推論相符[8]。底物酶譜法分析表明Ace-TIMP 蛋白可以抑制MMP-2 的活性。

本研究首次從犬源錫蘭鉤蟲成蟲中克隆TIMP基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體并進(jìn)行體外表達(dá)，對其序列進(jìn)行了多重比對和遺傳進(jìn)化分析，并驗(yàn)證了其抑制MMP 活性的功能，為深入研究錫蘭鉤蟲TIMP的生物學(xué)功能及其免疫潛能奠定了基礎(chǔ)。