梁紅茹，蔡秀珠，范芷儀，林 強(qiáng)，付小哲，劉禮輝，黃志斌，牛銀杰，林 蠡，李寧求*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510380；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東廣州570228)

鱖魚(Siniperca chuatsi)是一種肉質(zhì)優(yōu)良的名優(yōu)魚類，味道鮮美，肉質(zhì)鮮嫩、蛋白含量高，市場需求量大，經(jīng)濟(jì)效益較高[1]。隨著鱖魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大及養(yǎng)殖密度的提高，疾病的發(fā)生已成為鱖魚養(yǎng)殖業(yè)主要“瓶頸”之一。其中，鱖彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)感染引起的病毒性疾病可以導(dǎo)致鱖魚大批死亡，發(fā)病嚴(yán)重的魚池死亡率超過90 %[2]，該病流行廣，在珠江三角洲普遍發(fā)生。魚類感染SCRV 后典型的病狀是出血性敗血癥，影響多種器官功能，如眼球突出變黑，腹部膨脹，皮下出血[3]。目前尚無針對該病原的有效治療方法。

SCRV 屬于彈狀病毒科，為單股負(fù)鏈RNA 病毒，其基因組全長為11545 核苷酸，由核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA依賴的RNA 聚合酶蛋白(L)5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成[4]。彈狀病毒N 蛋白較為保守，可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 個(gè)區(qū)域，而區(qū)域Ⅱ的氨基酸序列較為保守，是病毒復(fù)制所需的蛋白[5]。

病毒檢測主要通過常規(guī)PCR 和病毒分離鑒定等常規(guī)方法[6]，但熒光定量PCR 技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、可靠性強(qiáng)和實(shí)時(shí)準(zhǔn)確等特點(diǎn)[7-10]。目前，針對魚類彈狀病毒的檢測方法主要為普通PCR，因此本研究針對SCRV N 基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立 SCRV 的TaqMan 熒光定量 PCR 檢測方法，為SCRV 的定性和定量檢測、該病防控提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品SCRV、 草魚出血病病毒(GCRV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、羅非魚湖病毒(TiLV)、石斑魚虹彩病毒(SGIV)、傳染性脾腎壞死病病毒(ISKNV)、神經(jīng)壞死病毒(NNV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所保存。35 份臨床樣品為2018年8 月～2018年10 月采集自廣東佛山、東莞等地養(yǎng)殖魚塘疑似發(fā)病魚的腎、脾、肝、腦等組織。

1.2 主要試劑2×EasyTaqSuper Mix (TRANS)、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、TRIzol 試劑購、RNA提取試劑盒均購自全式金生物技術(shù)公司；Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、 ROX Reference Dye Ⅱ 、EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TRANS)反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 中SCRV N 基因序列(NC008514.1)，應(yīng)用Primer5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，第一對引物(SCRV-N-F/SCRV-N-R)擴(kuò)增SCRV N 基因的ORF 框，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 290 bp，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；第二對引物(Rhabdovirus140-F/Rhabdovirus140-R)和探針(Rhabdovirus140 TAP)用于熒光定量PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為140 bp。引物和探針由廣州擎科生物科技有限公司合成。引物和探針序列為：

SCRV-N-F：5'-ATGGAAAACCAAATCATCAAGAG-3'/SCRV-N-R： 5'-TCACAAAGCTTGGTGTTTCAGC-3'；Rhabdovirus140-F：5'-GACATGTTCTTCTACAGATTC AAC-3'/Rhabdovirus140-R：5'-CAATCCAGCACTCCA CTG-3'；Rhabdovirus140 TAP：5'-AGGTTCAAAGAC TGTGCAGCTCTGT-3'。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備利用TRIzol 法提取SCRV 病毒總 RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA 為模板，SCRV-N-F/SCRV-N-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。同時(shí)以滅菌水為模板作為陰性對照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化回收后連接pMD19-T 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR 和測序鑒定陽性重組質(zhì)粒作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用微量分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的濃度。根據(jù)公式拷貝數(shù) /μL=(ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/DNA length×660)將其換算成相應(yīng)的拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR 的條件優(yōu)化采用TaqMan 探針技術(shù)，參照Premix ExTaqTM(Probe qPCR)說明書建立20 μL 反應(yīng)體系，采用矩陣法對引物(0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L)和探針濃度(0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.5 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L)進(jìn)行優(yōu)化，初步建立熒光定量PCR 檢測方法。

利用EASY Dilution 將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品配制后10 倍倍比稀釋(1×108拷貝 /μL～1×101拷貝 /μL)，分別以其為模板，以滅菌的ddH2O 為陰性對照，采用建立的TaqMan 熒光定量PCR 進(jìn)行檢測，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)利用DNA 提取試劑盒提取ISKNV、KHV、SGIV 等DNA，利用RNA 提取試劑盒提取 SCRV、 GCRV、 TiLV、 NNV、 SVCV 等RNA 后反轉(zhuǎn)為cDNA 備用。分別以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、ISKNV、 KHV、 SGIV 提 取 的 DNA 和 SCRV、GCRV、TiLV、NNV、SVCV 的 cDNA 為模板，利用本研究建立的SCRVTaqMan 熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，設(shè)滅菌ddH2O 為陰性對照，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋(1×108拷貝 /μL～1×101拷貝 /μL)，分別以其為模板，以滅菌ddH2O 為陰性對照，分別利用本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 和1.4 中常規(guī) PCR 方法進(jìn)行檢測，以評估該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)選取 1×108拷貝 /μL、1×106拷貝 /μL、1×104拷貝 /μL 這 3 個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個(gè)濃度重復(fù)3 次，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；將上述3 個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每間隔3 d 檢測1 次，連續(xù)檢測3 次，進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)Ct 值計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，評價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測按常規(guī)方法對收集的35 份臨床樣品處理后，利用DNA/RNA 共提取試劑盒操作步驟提取樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，同時(shí)利用本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法和1.4 中常規(guī)PCR 方法對35 份臨床樣品核酸進(jìn)行檢測，比較二者檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備與鑒定結(jié)果以提取的SCRV 的cDNA 為模板PCR 擴(kuò)增后結(jié)果顯示，目的條帶約為1 300 bp (圖1)，與預(yù)期相符。目的片段回收純化后克隆至載體pMD19-T 中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)PCR 和測序鑒定，結(jié)果顯示目的片段與預(yù)期插入片段相同，表明重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品正確構(gòu)建。經(jīng)檢測計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為159 ng/μL。經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為1.12×1011拷貝/μL。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of recombinant plasmid

2.2 熒光定量PCR 的條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用矩陣法優(yōu)化后，20 μL 反應(yīng)體系為：Premix Ex-TaqTM10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.5 μL，上下游引物各 0.6 μL，探針 0.6 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 6.7 μL，總體系為 20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 個(gè)循環(huán)。

以10 倍倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行TaqMan 熒光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)結(jié)果獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.163x+45.216，相關(guān)系數(shù)為0.999，熒光定量 PCR 在 1×108拷貝 /μL～1×101拷貝 /μL 范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

圖2 SCRV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of real-time PCR assay for the detection of SCRV plamid

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法分別對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、ISKNV、SCRV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、 SVCV 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，除質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和SCRV 檢測結(jié)果為陽性外，其它樣品均為陰性(圖3)，表明本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 SCRV TaqMan real-time PCR 特異性檢測結(jié)果Fig.3 Specificity assay of the real-time PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按照10 倍倍比稀釋，分別采用常規(guī)PCR 和TaqMan 熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，TaqMan 熒光定量PCR 方法最低檢測濃度為 102拷貝 /μL，常規(guī) PCR方法最低檢測濃度 1.0×104拷貝 /μL (圖 4)。二者陰性對照均無擴(kuò)增，TaqMan 熒光定量PCR 的敏感性是常規(guī)PCR 的100 倍。表明本研究建立的TaqMan熒光定量PCR 方法敏感性較高。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果選取3 個(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2 % (表1)，表明建立的Taq-Man 熒光定量PCR 方法具有良好的重復(fù)性。

圖4 SCRV 熒光定量PCR(A)和常規(guī)PCR(B)敏感性檢測結(jié)果Fig.4 Sensitivity analysis of the SCRV real-time PCR (A)and the conventional PCR (B)

表1 SCRV 熒光定量PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Reproducibility assay of the SCRV TaqMan real-time PCR

2.6 臨床樣品檢測利用建立的SCRVTaqMan 熒光定量PCR 方法對35 份臨床樣品進(jìn)行檢測，熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示陽性樣品11 份，檢出率為31 %，常規(guī)PCR 檢測結(jié)果顯示陽性樣品為5 份，檢出率僅為14 %。表明建立的TaqMan 熒光定量PCR方法可用于臨床樣品中SCRV 的檢測，且比常規(guī)PCR 方法敏感。

3 討 論

SCRV 具有很強(qiáng)的傳染性、流行性和致病性，可感染鱖魚、生魚、加州鱸等多種魚類[11]。目前國內(nèi)外關(guān)于彈狀病毒基于G 蛋白、N 蛋白建立的檢測方法最為常見[12-14]，對于魚類彈狀病毒，尤其SCRV的研究較少。SCRV 分離鑒定方法耗時(shí)長，周期較長，不利于該病的快速診斷，常規(guī)PCR 敏感性較低，不能夠?qū)Σ《具M(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測分析[15]。因此，建立快速檢測SCRV 的方法并應(yīng)用，對預(yù)防魚類感染SCRV 及減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失顯得十分重要。熒光定量PCR 技術(shù)可分為熒光染料(SYBR GreenⅠ)法和TaqMan 探針法，具有靈敏度高、特異性好、可靠性強(qiáng)和實(shí)時(shí)準(zhǔn)確等特點(diǎn)，目前是實(shí)驗(yàn)室重要的檢測技術(shù)[16]，但SYBR GreenⅠ對DNA 模板無選擇性，能夠與所有的DNA 雙鏈相結(jié)合，因此特異性比TaqMan 探針差。TaqMan 探針法的定量PCR 反應(yīng)體系中包含一對PCR 引物和一條探針，探針只與DNA 模板特異性結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間，避免了假陽性問題，同時(shí)可通過模板的Ct 值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)對起始模板進(jìn)行定量[17-18]，而且針對SCRV 建立的實(shí)時(shí)定量的檢測方法也很少。

由于N 蛋白是彈狀病毒5 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中一個(gè)較為保守的蛋白，所以本研究針對SCRV 的N 蛋白基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan 探針，建立SCRV 的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2為 0.999，在 108拷貝 /μL～101拷貝/μL 范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系；以上研究表明該方法可以高效的檢出病毒；此外，該方法對魚類其它病毒檢測結(jié)果為陽性，例如ISKNV、GCRV、KHV、SGIV、TiLV、NNV、SVCV，證實(shí)該方法的特異性強(qiáng)。該方法與許運(yùn)斌等以基因Ⅰ型狂犬病病毒(Rabies virus，RV)N 基因建立的TaqMan 熒光定量檢測方法特異性結(jié)果相當(dāng)，均對其它病毒樣品無陽性信號[19]；組內(nèi)變異系數(shù)在0.303 %～1.587 %，組間變異系數(shù)在0.601 %～0.748 %，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2 %，表明該方法具有較高的重復(fù)性和較好的穩(wěn)定性；曾偉偉等研究發(fā)現(xiàn)SCRV 與雜交鱧彈狀病毒 C1207 株(Hybrid snakehead rhabdovirus-C1207，HSHRV-C1207)親緣關(guān)系較近，但二者在病毒特性方面存在差異，因此，針對保守基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針更有必要性[20]。劉春等根據(jù)HSHRV-C1207 G 蛋白建立的TaqMan 熒光定量 PCR方法也可檢測SCRV，其主要針對糖蛋白設(shè)計(jì)引物和探針，但彈狀病毒糖蛋白的相對變異性較大[12]。本研究建立的SCRV 熒光定量PCR 檢測方法最低可檢測到100 拷貝/μL，比常規(guī)PCR 方法靈敏100 倍，與岳志芹等建立的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious haematopoieticnecrosis，IHN)的 N 基因TaqMan熒光定量PCR 檢測方法結(jié)果相似[22]。因此，本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法可以更加快速、特異檢測出SCRV，便于及時(shí)防控該病，減少經(jīng)濟(jì)損失。

應(yīng)用本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 方法對來自廣東東莞、佛山等地的35 份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示陽性檢出率為31 %，比常規(guī)PCR 陽性檢出率高，證實(shí)建立的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法在臨床檢測應(yīng)用中的可靠性和敏感性均較高，可以用于SCRV 的快速檢測。

本研究建立的TaqMan 熒光定量PCR 檢測方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，能夠快速、準(zhǔn)確地對SCRV 進(jìn)行定量分析，對鱖魚彈狀病毒的快速檢測及防控該病具有重要意義。