賈宇旻，徐 飛，邊洪芬，王 娟，賈愛卿，唐 勇，賈杏林

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州511400；3.暨南大學生物工程學系/ 廣東省抗體藥物與免疫檢測工程技術研究中心，廣東廣州510632)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性胃腸道傳染病。不同年齡段的豬均可以感染，對仔豬危害更嚴重。患病仔豬主要癥狀有嘔吐、水樣腹瀉和脫水等，新生仔豬死亡率可高達90 %。我國于1976年首次報道該病，2010年冬季數(shù)省持續(xù)暴發(fā)PED，至今多地仍有該病的發(fā)生，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失[1]。PED 的臨床癥狀和病理變化與豬傳染性胃腸炎等其它以嘔吐、腹瀉為特征的豬傳染病較為相似，臨床上難以鑒別。目前常見的檢測PEDV 的方法有RT-PCR[2]和ELISA[3]等，其靈敏度高、特異性強，但檢測耗時較長，對操作人員和設備條件要求較高，多用于實驗室，不適合現(xiàn)場快速檢測。因此建立一種使用方便、快速準確的檢測方法，對PED 的診斷和防控尤為重要。膠體金免疫層析技術(GICA)具有準確性高、使用簡便、快速等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于生物醫(yī)藥等領域。本研究以PEDV 中國南方分離株CHYJ130330 株[4]為基礎制備抗PEDV 的單克隆抗體(MAb)，并以此初步建立檢測PEDV 的GICA，為研制商品化的PEDV快速檢測膠體金試紙條奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料Vero 細胞、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)疫苗株(TGEV H 株)由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院提供；PEDV CHYJ130330 株(KJ020932)由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院分離鑒定；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗株(JXA1-R)、豬偽狂犬病毒(PRV)疫苗株(Bartha-K61)和豬瘟病毒(CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)均由廣東永順生物制藥股份有限公司提供；SP2/0 骨髓瘤細胞購自上海細胞生物學研究所；SPF 級BALB/c 小鼠(6 周齡)購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

胎牛血清(FBS)、DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；PEG-50 % (1450)、HAT、HT、弗氏不完全佐劑均購自Sigma 公司；MONTANIDE GEL 01 佐劑購自 SEPPIC 公司；鼠 MAb 亞類鑒定試劑盒購自Proteintech 公司；Protein G 親和層析柱購自GE 公司；山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-FITC 購自KPL 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo 公司；HRP 標記抗體試劑盒購自北京泰天河生物技術有限公司；核酸提取試劑盒購自Omega 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；PCR 引物由上海生物工程有限公司合成；硝酸纖維素膜(NC 膜)、樣品墊、結(jié)合墊，購自Millipore 公司；吸水墊購自上海捷寧生物科技有限公司；O-leyl-PEG-NHS 偶聯(lián)劑由本實驗室合成。

后備母豬及育肥豬糞便樣品39 份、未斷奶仔豬糞便及小腸內(nèi)容物樣品76 份，于2017年 ～2018年采集自廣東、廣西6 個大型發(fā)生腹瀉病的豬場。樣品分裝后-40 ℃凍存。

1.2 MAb 的制備參照文獻[5]的方法，用PEDV免疫BALB/c 小鼠，制備免疫脾細胞。計數(shù)后按5.6∶1 的比例與 SP2/0 細胞混勻，在 PEG-50 %作用下融合后靜置培養(yǎng)5 d～7 d[6]。

將PEDV 與Oleyl-PEG-NHS 偶聯(lián)劑偶聯(lián)。棄去上述細胞孔中培養(yǎng)上清，將偶聯(lián)復合物與山羊抗小鼠IgG-FITC 混合，稀釋后按每孔100 μL 滴加到細胞孔中，37 ℃靜置孵育1h 后洗滌3 次，每孔加入200 μL 1640 培養(yǎng)基。SP2/0 細胞孔同法處理后作為陰性對照孔。參照文獻[7]采用表面熒光吸附法(CSFIA)篩選雜交瘤細胞。將鏡下觀察到熒光信號的細胞孔標記為陽性，并轉(zhuǎn)移擴大培養(yǎng)。

將PEDV 按100 ng/孔包被酶標板，以雜交瘤細胞培養(yǎng)上清為一抗，以HRP 標記山羊抗小鼠IgG 抗體為二抗，以PEDV 免疫小鼠血清為陽性對照，未免疫小鼠血清為陰性對照，PBS 為空白對照，利用間接ELISA 方法篩選雜交瘤細胞。采用有限稀釋法將抗體陽性孔的細胞多次克隆純化，將能夠穩(wěn)定分泌抗PEDV 抗體的雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)[8]。

用兩種方法篩選克隆后得到的細胞株制備腹水并通過間接ELISA 檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水的效價[5]。

1.3 MAb 的鑒定將腹水利用PBS 2 倍倍比稀釋(1∶800～1∶128 000)，參照 1.2 中 ELISA 方法測定其效價，空白小鼠腹腔注射SP2/0 細胞所得腹水為陰性對照，PBS 為空白對照。同時，參照MAb 亞型鑒定試劑盒說明書檢測MAb 的Ig 亞型及輕鏈類型。分別以PEDV、TGEV、PRV 包被酶標板，以MAb為一抗，參照1.2 的間接ELISA 法檢測MAb 的特異性。

1.4 MAb 的純化及配對取效價較高的腹水經(jīng)辛酸- 硫酸銨方法沉淀后再經(jīng)Protein G 親和層析柱純化。用HRP 標記的抗體試劑盒標記純化MAb 并通過間接ELISA 檢測其效價[8]，參照文獻[9]中雙抗體夾心ELISA 對MAb 進行方陣法配對。其中HRP 標記的MAb 作為檢測抗體，未標記的另外一株MAb作為俘獲抗體。

1.5 膠體金免疫層析試紙的制備參照文獻的方法制備抗PEDV 的免疫膠體金溶膠(AuNPs-MAb)，并采用雙抗體夾心法制備膠體金免疫層析試紙條[10]。

1.6 PEDV 膠體金免疫層析檢測法的優(yōu)化參照文獻[10]對膠體金微粒的大小、樣品墊的種類、結(jié)合墊的種類、NC 膜的種類、吸水墊的類型及Tween-20 的用量和AuNPs-mAb 的噴涂量等條件進行優(yōu)化試驗。

1.7 PEDV 膠體金免疫層析檢測法評價

1.7.1 特異性試驗 采用優(yōu)化后的膠體金免疫層析試紙條對PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、TGEV 進行檢測，以PBS 為空白對照，每份樣品重復檢測2次。評價該方法的特異性。

1.7.2 敏感性試驗 將10 g/mL (1.2×105TCID50/mL)PEDV經(jīng) PBS 2 倍倍比稀釋(0、0.625 g/mL、1.25 g/mL、2.5 g/mL、5 g/mL、10 g/mL)后，采用優(yōu)化后的膠體金免疫層析試紙條檢測，每份樣品重復檢測2 次。評估該方法的敏感性。

1.7.3 重復性試驗 隨機選取豬糞樣品8 份，向樣品中加入等量PB 溶液混合后靜置5 min，離心10 min后取 80 mL 上清檢測；再取 PEDV 病毒液 1 份、PBS 溶液1 份。選取同批次試紙條同時對每份樣品重復檢測3 次；選取3 個不同批次的試紙條對上述樣品進行檢測，觀察結(jié)果，評價試紙條的重復性。

1.8 臨床樣品檢測將豬糞樣品參照1.7 處理后待檢；小腸內(nèi)容物離心10 min 后取上清待檢。采用本研究建立的PEDV 膠體金免疫層析試紙條對115 份臨床處理的樣品進行檢測；同時將上述處理樣品用RT-PCR[2]同時檢測，比較二者的檢測結(jié)果，計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 MAb 的篩選與鑒定結(jié)果通過間接ELISA 法篩選、有限稀釋法3 次克隆純化得到11 株陽性雜交瘤細胞；通過CSFIA 法篩選得到22 株陽性雜交瘤細胞。33 株細胞根據(jù)原始孔編號命名，結(jié)果見表1。

采用間接ELISA 方法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清的效價，效價高于 1∶160 的有 15 株(13H9、8G12、9D12、 6D10、 3C11F9、 3C11F5、 4H7、 12D12、2F3、3A11、5A10、3G10、3G9、5H9、5A9)；同法測定腹水效價，結(jié)果見表1。

表1 33 株PEDV MAb 效價檢測結(jié)果Table 1 Detection of the titers of 33 strain MAbs against PEDV

MAb 亞型鑒定結(jié)果顯示，效價均高于1∶1.6×104的 21 株 MAb 中 ， 11B11、 13H9、 8G12、 12D12、2F3、3A11、5A10 為 IgG1；其余的 MAb 亞型均為IgG2a；所有抗體的輕鏈類型均為kappa 鏈。

MAb 特異性檢測結(jié)果顯示效價高于1∶1.6×104的21 株被檢MAb 除了與PEDV 反應外，均不與TGEV 和 PRV 結(jié)合(圖1)，表明這些 MAb 均具有較強的特異性。

圖1 21 株PEDV MAb 特異性鑒定結(jié)果Fig.1 Specificity assay results of 21 strain MAbs against PEDV

2.2 MAb 夾心 ELISA 配對結(jié)果共有 5 株 MAb(2H2、4A11、4H7、5A9、5H9)通過夾心 ELISA 配對成功。選取效果最佳的4H7 為檢測抗體，5A9 為俘獲抗體制備膠體金免疫層析試紙條。

2.3 PEDV 膠體金免疫層析檢測法的建立膠體金免疫層析試紙條條件優(yōu)化結(jié)果：膠體金顆粒為40 nm，樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜、吸水墊的類型分別為GL-B04、聚酯膜、MILLIPORE135 和 H-2，樣品墊封閉緩沖液Tween-20 的使用量為10 μL/mL，金標墊 AuNPs-mAb 噴量為 5 μL/cm。

免疫層析試紙條的特異性試驗結(jié)果顯示，除PEDV 的檢測結(jié)果為陽性外，該試紙條對PRV、CSFV、PRRSV、TGEV、PBS 的檢測結(jié)果均為陰性(圖2)。表明該膠體金免疫層析試紙條具有較強的特異性。

圖2 PEDV 膠體金試紙條特異性試驗結(jié)果Fig.2 Specificity assay results of colloidal gold immunochromatographic strip of PEDV

試紙條敏感性試驗結(jié)果顯示，PEDV 含量等于或大于0.625 μg/mL 時，該試紙條T 線可見顯色條帶(圖3)，可判定其最低檢出限(LOD)為 0.625 μg/mL (7.8×103TCID50/mL)。表明該方法的敏感性較高。

使用同批次制備的試紙條對10 份樣品重復檢測3 次，結(jié)果均相同；使用3 個不同批次的試紙條對上述樣品進行檢測，結(jié)果均相同；表明該膠體金免疫層析試紙條具有較好的重復性。

圖3 PEDV 膠體金試紙條敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity assay of colloidal gold immunochromatographic strip of PEDV

2.4 臨床樣品的檢測結(jié)果分別通過GICA 和RT-PCR[2]對115 份臨床樣品進行平行檢測，結(jié)果顯示GICA 陽性檢出率為55.6 %，RT-PCR 的陽性檢出率為53.9 %，兩者符合率為93 % (表2)。結(jié)果表明本研究所制備的MAb 可以應用于臨床檢測PEDV的膠體金免疫層析試紙條的開發(fā)。

表2 臨床樣品檢測結(jié)果Table 2 Detection results of clinical samples

3 討 論

本研究以中國分離的PEDVCHYJ130330 株免疫小鼠，通過ELISA 法和CSFIA 法一共篩選了33 株穩(wěn)定分泌抗PEDV MAb 的雜交瘤細胞株。在篩選陽性克隆及后續(xù)克隆純化的過程中本研究發(fā)現(xiàn)，CSFIA 從細胞融合至得到穩(wěn)定分泌PEDV MAb 的細胞株，所需時間較少，間接ELISA 方法耗時13 周，是 CSFIA 的 3 倍。CSFIA 的另一優(yōu)勢是比間接ELISA 獲得的陽性細胞株數(shù)量更多。在陽性雜交瘤細胞克隆過程中，新型的CSFIA 篩選法陽性信號更直觀、觀察更及時，降低了在多次克隆純化過程中丟失陽性克隆的幾率，明顯提高了MAb 制備的效率，是一種更高效的篩選方法。

檢測PEDV 的方法有病毒分離鑒定、免疫熒光法(IFA)、ELISA[3]、GICA[11]、RT-PCR[2,12]、Q-PCR[13]、環(huán)介導等溫核酸擴增技術(LAMP)[14]等。GICA 與其它方法相比，在保證準確率且能夠與豬的其它腹瀉類傳染病鑒別檢測的同時，其樣品處理、檢測、結(jié)果判定等環(huán)節(jié)更為簡便快捷，對設備條件和專業(yè)人員的依賴較小，檢測成本較低，在豬場大量臨床樣品的篩查方面有著較大的優(yōu)勢。RT-PCR 常用于PEDV 的實驗室檢測，有著更高的靈敏度和準確率，且在PEDV 的分子流行病學調(diào)查方面發(fā)揮著重要的作用[2,12]。本研究以PEDV 為免疫原制備了抗PEDV MAb 并以此建立了檢測PEDV 的GICA，該方法與RT-PCR 對臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，二者符合率達到93 %，前者檢測出的陽性率略高于后者，且存在假陽性結(jié)果，提示在后續(xù)工作中，還需要通過優(yōu)化條件、改進試紙條制備工藝、探究新的示蹤物等方面進一步提高該方法的檢測準確度、靈敏度。PEDV GICA 的初步建立，為開發(fā)PEDV 快速檢測膠體金試紙條奠定了扎實的基礎。